（一）聚乙二醇沉淀法質粒ＤＮＡ
這里介紹的方法（R.Tresman,個人通訊）已卓有成效地用于純化堿裂解法制備的質粒ＤＮＡ。
１）將核酸溶液[上頁步驟９）所得]轉入15mlＣorex 管中， 再加3ml 用冰預冷的5mol/L LiCl溶液，充分混勻，用Ｓorvall SS34 轉頭（或與其相當?shù)霓D頭）于４℃下以10 000轉/分離心10分鐘。LiCl可沉淀高分子ＲＮＡ。
２）將上清轉移到另一30mlCorex管內，加等量的異丙醇， 充分混勻，用SorvallSS34轉頭（或與其相當?shù)霓D尖）于室溫以10 000轉/分離心10分釧， 回收沉淀的核酸。
３）小心去掉上清，敞開管口，將管倒置以使最后殘留的液滴流盡。于室溫用70％乙醇洗滌沉淀及管壁，流盡乙醇，用與真空裝置相連的巴其德吸管吸去附于管壁的所有液滴，敞開管口并將管侄置，在紙巾上放置幾分鐘，以使最后殘余的痕量乙醇蒸發(fā)殆盡。
４）用500μl含無ＤＮＡ酶的胰ＲＮＡ酶(20μg/ml ）的ＴＥ（pH8.0）溶解沉淀，將溶液轉到一微量離心管中，于室溫放置30分鐘。
５）加500μl含13％（w/v)聚乙二醇（PEG 8000）的1.6mol/L NaCl,充分混合，用微量離心機于４℃以12000g離心５分鐘，以回收質粒ＤＮＡ。
６）吸出上清，用400μl TE(pH8.0)溶解質粒ＤＮＡ沉淀。用酚、酚：氯仿、氯仿各抽１次。
７）將水相轉到另一微量離心管中，加100μl 10mol/L乙醇銨，充分混勻，加２倍體積（約1ml）乙醇，于室溫放置10分鐘，于４℃以12 000g離心５分鐘，以回收沉淀的質粒ＤＮＡ。
８）吸去上清，加200μl處于４℃以12 000g離心２分鐘。
９）吸去上清，敞開管口，將管置于實驗桌上直到最后可見的痕量乙醇蒸發(fā)殆盡。
10）用500μlＴＥ（pH8.0）溶解沉淀1:100稀釋[用ＴＥ（pH8.0)] 后測量ＯＤ260，計算質粒ＤＮＡ的濃度（１ＯＤ260＝50μg質粒ＤＮＡ/ml）， 然后將ＤＮＡ貯于－20℃。
（二）氯化銫－溴化乙錠梯度平衡離心法純化閉環(huán)ＤＮＡ
１．連續(xù)梯度
１）測量ＤＮＡ溶液的體積，按lg/ml的用量精確地加入固體CsCl, 將溶液加溫至30℃助溶。溫和地混勻溶液直到鹽溶解。
２）每10mlＤＮＡ溶液加入0.8ml溴化乙錠溶液（10mg/ml溶于水）；立即將溴化乙錠溶液（漂浮在表成）與ＤＮＡ－氯化銫溶液混勻， 溶液的終密度應為1.55g/ml（溶液的折射率為1.3860）溴化乙錠濃度應為大約７４０μg/ml。溴化乙錠貯存液應貯存于避光容器內（如用錫箔完全包裹的瓶子）。于室溫保存。
３）于室溫用Sorvall SS34頭（或與其相當?shù)霓D頭）以8000轉/分離心５分鐘， 浮在溶液上面的水垢狀浮渣是溴化乙錠和細菌蛋白所形成的復合物。
４）用巴斯德吸管或帶大號針頭的一次性注射器將浮渣下的清亮紅色溶液轉移到適用于Beckman Ti65重直轉頭或Ｔi50、Ti65或Ti70 角轉頭（或與它們相當?shù)霓D頭）
的離心管（Beckman Quick-seal或與之相當?shù)碾x心管）中。用輕石蠟油加滿管的其余部分并封口。
５）于20℃對所得的密度梯度以45 000轉/分離心16小時（VTi65 轉頭）、 以45 000轉/分離心48小時（Ti50轉頭）、以60 000轉/分離心24小時（Ti65轉頭）或者以60 000轉/分離心24小時（Ti70.1轉頭）。在普通光照下，在梯中心可見兩條ＤＮＡ區(qū)帶， 上部區(qū)帶材料通常較少，由線狀的細菌（染色體）ＤＮＡ和帶切口的環(huán)狀質粒ＤＮＡ組成：下部區(qū)帶則由閉環(huán)質粒ＤＮＡ組成。管底部深紅色的沉淀是溴化乙錠ＲＮＡ復合物，位于ＣsCl溶液和石蠟油之間的是蛋白質。Beckman Quick-Seal離心管中的CsCl－溴化乙錠梯度可容納4mg 閉環(huán)質粒ＤＮＡ而不至超負荷。如有更大量的質粒存在，將擴展為一條寬帶，并與染色體ＤＮＡ相重疊。這種問題只有在質粒復制達到極高水平時才會出現(xiàn)，只要將該質粒提取物分為２個梯度即可解決。如出現(xiàn)負荷，可收集整個ＤＮＡ區(qū)高水平時才會出現(xiàn)，只要產將該質粒提取物分為２個梯度即可解決。如出現(xiàn)超負荷，可收集整個ＤＮＡ區(qū)帶，用CsCl溶液（ρ＝1.58g/ml）將體積調到15ml，在兩個離心管中再度離心，使ＤＮＡ達到平衡。
６）收集ＤＮＡ帶。將21 號皮下注射針頭插入管的頂端以使空氣進入，為盡量減少污染的機會，首先用１８號皮下注射針頭按下述方法收集上部的區(qū)帶（雜色體ＤＮＡ）：用乙醇小心擦拭管外壁以除去任何油脂，然后用一塊Soctch膠帶貼于管外壁。穿過Soctch膠帶將１８號皮下注身針頭（其斜面向上）斤插入管中，以便使針頭的斜面開口恰好位于染色體ＤＮＡ區(qū)帶之下并與該區(qū)帶相平行。將粘稠狀ＤＮＡ收集到一次性使用的管內，用造型粘土塊封信皮下注射針頭的未端并將第２根針頭留于原處。 穿過Soctch 膠帶插入第３根皮下注射針頭（18號），將下部的質粒ＤＮＡ區(qū)帶收集到玻璃或塑料管中。
２．不連續(xù)梯度
該方法是將含不同濃度CsCl的溶液分層加到離心管中，這樣可以加速CsCl梯度的形成，使離心時間減少到６小時。
１）將125gCsCl加到167ml(pH8.0)中，制成CsCl溶液（ρ＝1.47g/ml）。
２）將8ml氯化銫溶液加到Beckman Quick-Seal 離心管（或與其相當?shù)墓埽┲校瑪R置一旁等步聚８）使用。
３）如有必要，可酌情用TE(pH8.0)將質粒ＤＮＡ溶液的體積精確地調到3ml。
４）在質粒ＤＮＡ溶液中加入8.4gCsCl,將溶液加溫至30℃以促進鹽溶解， 小心地混勻溶液直至鹽溶解。
５）稱量溶液重量并加入TE(pH8.0)直到溶液重量恰好達13.2g，用天平稱量時應注意去除管的重量。
６）加入0.8ml溴化乙錠溶液（10mg/ml溶于水），快速混勻溶液直至染料均勻地分散，此時溶液瓣體積應大約為7.5ml。溴化乙錠貯存液應于室溫貯存在避光容器中（如完全用錫箔包裹的瓶子）。小心：溴化乙錠是一咱強誘變劑，并在中度毒性。
接觸含有該染料的溶液應戴手套。
７）于室溫用Sorvall SS34轉頭（或與之相當?shù)霓D法）以8000轉/ 分離心５分鐘，浮在液面上的水垢狀浮渣是溴化乙錠和細菌蛋白所形成的復合物。
８）將－22.86cm的巴期德吸管放入裝有步驟２）制備的CsCl的離心管中， 吸頭應接觸管底。用吸管小心地將步驟７所制備的清亮紅色溶液（來自浮渣之下）加入管內，使樣本層位CsCl溶液（1.47g/ml）之下。如有必要，可酌情步驟１）中制備的CsCl溶液（ρ=1.47g/ml)添滿離心管，封口。
９）將封口的管，（與相應的平衡管一起）放入Beckman Ti70. 1 或Sorvall65.13轉頭（或與之相當?shù)霓D頭中），于20℃以60 000轉/分將密度梯度離心６小時。
10）回收閉環(huán)質粒ＤＮＡ區(qū)帶
（三）從經(jīng)過純化的質粒ＤＮＡ中去除溴化乙錠
下面方法對于從經(jīng)過氯化銫－溴化乙錠梯度平衡離心純化的ＤＮＡ中去除溴化乙錠都同樣奏效。
方法：有機溶劑抽提
小心：溴化乙錠是一種強誘變劑，并有中度毒性。接觸含有該染料的溶液應戴手套。用后這些溶液應用后述的方法進行凈化處理。
１）將ＤＮＡ溶液放入玻璃或塑料管中，加等體積的水飽和１－丁醇或異戊醇。
２）振蕩混合兩相。
３）用臺式離心機于室溫以1500轉/分離心３分鐘。
４）用巴期德吸管將下層水相移至一干凈的玻璃或塑料管內。
５）反復抽提[步驟１）－４）]４－６次直到粉紅色從水相和有機相中均消失。
６）用以下任意一種方法從ＤＮＡ溶液中除CsCl：通過微量濃縮器（Amicon）進行旋轉透析，對TE(pH8.0)透析24-48小時，并換液數(shù)次或者用３倍體積水進行稀釋并于４℃用２倍體積乙醇（即終體積相當于原未稀釋體積的６倍）沉淀Ｄ15分鐘，再于４℃以10 000g 離心15 分釧， 將沉淀的ＤＮＡ溶于約1ml TE(pH8.0)中。如將ＤＮＡ的乙醇溶液置于-20℃，CsCl會沉淀。
７）測定ＤＮＡ終溶液的ＯＤ260值，計算ＤＮＡ的濃度， 將ＤＮＡ分成小份貯存于-20℃。如果終制備的ＤＮＡ含有顯著量的溴化乙錠（依顏色判斷），可用酚、酚：氯仿各抽提１次，然后用乙醇沉淀ＤＮＡ。
（四）溴化乙錠溶液的凈化處理
小心：溴化乙錠是強誘變劑，并有中度毒性，取用含有這一染料的溶液時務必戴上手套，這些溶液經(jīng)使用應按下面介紹的方法進行凈化處理。
１．溴化乙錠濃溶液（即濃度>0.5gm/ml的溴化乙錠沉溶液）的凈化處理
方法： 用少門氏菌－微粒體測定表明， 本方法（Lunn 和Sanaone,1987）可使溴化乙錠的誘變活性降低至原來的1/200左右。
１）加入足量的水使溴化乙錠的濃度降低至0.5mg/ml以下。
２）加入0.2體積新配制的５％次磷酸和0.12體各新配制的0.5mol/L 亞硝酸鈉，混勻。
切記：檢測該溶液的pH值應小于3.0。市售次磷酸一般為50％溶液，具有腐蝕性，應小心操作，必須現(xiàn)用現(xiàn)稀釋。亞硝酸鈉溶液（0.5mol/L）應用水溶解34.5g亞硝酸鈉并定容至終體積500ml，現(xiàn)用現(xiàn)配。
３）于室溫溫育24小時后，加入大大過量的1ml/L碳酸氫鈉。至些， 該溶液可予丟棄。返回
切記：檢測該溶液的pH值應小于3.0。市售次磷酸一般為50％溶液，具有腐蝕性，應小心操作，必須現(xiàn)用現(xiàn)稀釋。亞硝酸鈉溶液（0.5mol/L）應用水溶解34.5g亞硝酸鈉并定容至終體積500ml，現(xiàn)用現(xiàn)配。
３）于室溫溫育24小時后，加入大大過量的1ml/L碳酸氫鈉。至些， 該溶液可予丟棄。
(五）從質粒ＤＮＡ制品中去除ＲＮＡ
對于某些用途（例如用ＢＡＬ31進生活化或用Ｔ４噬菌體多核苷酸激酥標記質粒ＤＮＡ的限制切片段的５'端），必須獲得無ＲＮＡ污染的ＤＮＡ制品。盡管在通過氯化銫－化乙錠梯度平衡離心所制備的質粒ＤＮＡ中，這樣的ＲＮＡ污染物的重量微不卟道，但對說來，其中的ＲＮＡ分子數(shù)卻可能相當可觀，并可在限制酶消化反應的全部５'端中占據(jù)砂容忽視的比例。通過下述方法，可以從質粒制品中去除ＲＮA 。
２．通過Bio-Gel A-150m或Sepharose CL-4B進行層析
１）制備質粒ＤＮＡ。
２）有等體積的經(jīng)TE(pH8.0)平衡后的酚抽提１次。
３）將至多1ml的水相鋪在經(jīng)TE(pH8.0)和0.1％ＳＤＳ平衡的Bio-Gel A-150m或Sepharase CL-4B(1x10cm)柱上。
４）將ＤＮＡ裝入層柱并在柱的上部連接上含0.1％ＳＤＳ的TE(pH8.0)的貯液瓶，立即開始以0.5ml流出液為１流進行收集。
５）當收集到15份時，關閉柱底部，為明確質粒ＤＮＡ的分布情況，可心眾每份收集物中取10μg樣品，通過0.7％瓊脂糖凝膠電泳或溴化乙錠熒光（見附錄Ｅ）進行分析。
６）將含質粒ＤＮＡ的組成合并在一起，加２倍體積的乙醇于４℃沉淀10分鐘，然后于４℃以大于10 000g離心15分鐘，以回收ＤＮＡ。
