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PCR技術(shù)基本原理

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-07-06

PCR技術(shù)的基本原理 類似于DNA的天然復(fù)制過程,其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成:①模板DNA的變性:模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時間后,使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離,使之成為單鏈,以便它與引物結(jié)合,為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備;②模板DNA與引物的退火(復(fù)性):模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后,溫度降至55℃左右,引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合;③引物的延伸:DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP為反應(yīng)原料,靶序列為模板,按堿基配對與半保留復(fù)制原理,合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程,就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”,而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需2~4分鐘,2~3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。到達平臺期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。
PCR的反應(yīng)動力學(xué)  PCR的三個反應(yīng)步驟反復(fù)進行,使DNA擴增量呈指數(shù)上升。反應(yīng)最終的DNA 擴增量可用Y=(1+X)n計算。Y代表DNA片段擴增后的拷貝數(shù),X表示平(Y)均每次的擴增效率,n代表循環(huán)次數(shù)。平均擴增效率的理論值為100%,但在實際反應(yīng)中平均效率達不到理論值。反應(yīng)初期,靶序列DNA片段的增加呈指數(shù)形式,隨著PCR產(chǎn)物的逐漸積累,被擴增的DNA片段不再呈指數(shù)增加,而進入線性增長期或靜止期,即出現(xiàn)“停滯效應(yīng)”,這種效應(yīng)稱平臺期數(shù)、PCR擴增效率及DNA聚合酶PCR的種類和活性及非特異性產(chǎn)物的竟?fàn)幍纫蛩。大多?shù)情況下,平臺期的到來是不可避免的。
PCR擴增產(chǎn)物  可分為長產(chǎn)物片段和短產(chǎn)物片段兩部分。短產(chǎn)物片段的長度嚴(yán)格地限定在兩個引物鏈5’端之間,是需要擴增的特定片段。短產(chǎn)物片段和長產(chǎn)物片段是由于引物所結(jié)合的模板不一樣而形成的,以一個原始模板為例,在第一個反應(yīng)周期中,以兩條互補的DNA為模板,引物是從3’端開始延伸,其5’端是固定的,3’端則沒有固定的止點,長短不一,這就是“長產(chǎn)物片段”。進入第二周期后,引物除與原始模板結(jié)合外,還要同新合成的鏈(即“長產(chǎn)物片段”)結(jié)合。引物在與新鏈結(jié)合時,由于新鏈模板的5’端序列是固定的,這就等于這次延伸的片段3’端被固定了止點,保證了新片段的起點和止點都限定于引物擴增序列以內(nèi)、形成長短一致的“短產(chǎn)物片段”。不難看出“短產(chǎn)物片段”是按指數(shù)倍數(shù)增加,而“長產(chǎn)物片段”則以算術(shù)倍數(shù)增加,幾乎可以忽略不計,這使得PCR的反應(yīng)產(chǎn)物不需要再純化,就能保證足夠純DNA片段供分析與檢測用。
PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件 
標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系:
   10×擴增緩沖液    10ul
   4種dNTP混合物   各200umol/L
   引物         各10~100pmol 
   模板DNA       0.1~2ug 
    Taq DNA聚合酶   2.5u 
   Mg2         1.5mmol/L
   加雙或三蒸水至    100ul
PCR反應(yīng)五要素: 參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2
  引物: 引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵,PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上,只要知道任何一段模板DNA序列,就能按其設(shè)計互補的寡核苷酸鏈做引物,利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。
設(shè)計引物應(yīng)遵循以下原則:
 、僖镩L度: 15-30bp,常用為20bp左右。
 、谝飻U增跨度: 以200-500bp為宜,特定條件下可擴增長至10kb的片段。
 、垡飰A基:G C含量以40-60%為宜,G C太少擴增效果不佳,G C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機分布,避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
 、鼙苊庖飪(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu),避免兩條引物間互補,特別是3’端的互補,否則會形成引物二聚體,產(chǎn)生非特異的擴增條帶。
 、菀3’端的堿基,特別是最末及倒數(shù)第二個堿基,應(yīng)嚴(yán)格要求配對,以避免因末端堿基不配對而導(dǎo)致PCR失敗。
 、抟镏杏谢蚰芗由虾线m的酶切位點,被擴增的靶序列最好有適宜的酶切位點,這對酶切分析或分子克隆很有好處。
  ⑦引物的特異性:引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。
  引物量: 每條引物的濃度0.1~1umol或10~100pmol,以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好,引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增,且可增加引物之間形成二聚體的機會。
  酶及其濃度 目前有兩種Taq DNA聚合酶供應(yīng), 一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶,另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反應(yīng)約需酶量2.5U(指總反應(yīng)體積為100ul時),濃度過高可引起非特異性擴增,濃度過低則合成產(chǎn)物量減少。
  dNTP的質(zhì)量與濃度 dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴增效率有密切關(guān)系,dNTP粉呈顆粒狀,如保存不當(dāng)易變性失去生物學(xué)活性。dNTP溶液呈酸性,使用時應(yīng)配成高濃度后,以1M NaOH或1M Tris。HCL的緩沖液將其PH調(diào)節(jié)到7.0~7.5,小量分裝, -20℃冰凍保存。多次凍融會使dNTP降解。在PCR反應(yīng)中,dNTP應(yīng)為50~200umol/L,尤其是注意4種dNTP的濃度要相等( 等摩爾配制),如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(偏高或偏低),就會引起錯配。濃度過低又會降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。dNTP能與Mg2 結(jié)合,使游離的Mg2 濃度降低。
  模板(靶基因)核酸 模板核酸的量與純化程度,是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一,傳統(tǒng)的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K來消化處理標(biāo)本。SDS的主要功能是:溶解細胞膜上的脂類與蛋白質(zhì),因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜,并解離細胞中的核蛋白,SDS 還能與蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀;蛋白酶K能水解消化蛋白質(zhì),特別是與DNA結(jié)合的組蛋白,再用有機溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質(zhì)和其它細胞組份,用乙醇或異丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作為模板用于PCR反應(yīng)。一般臨床檢測標(biāo)本,可采用快速簡便的方法溶解細胞,裂解病原體,消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離,直接用于PCR擴增。RNA模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K法,要防止RNase降解RNA。
  Mg2 濃度 Mg2 對PCR擴增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響,在一般的PCR反應(yīng)中,各種dNTP濃度為200umol/L時,Mg2 濃度為1.5~2.0mmol/L為宜。Mg2 濃度過高,反應(yīng)特異性降低,出現(xiàn)非特異擴增,濃度過低會降低Taq DNA聚合酶的活性,使反應(yīng)產(chǎn)物減少。

 
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