實時定量PCR已廣泛地運用于分子生物學(xué)的各個領(lǐng)域，就目前的應(yīng)用情況來看，雖然取得了很好的效果，但是其在方法學(xué)上的選擇、敏感性問題、重復(fù)性問題等都一直是爭論不休的，本文將就這些問題做出探討。
1. 方法的選擇：研究者在實驗中往往想要得到目的基因的絕對量，因為絕對定量對目的基因的表達差異有直接的反映[38]。絕對定量最為簡單的方法就是標(biāo)準(zhǔn)曲線法，用一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，在同等條件下目的基因測得的熒光信號量同標(biāo)準(zhǔn)曲線進行比較，從而得到目的基因的量。該標(biāo)準(zhǔn)品可以是純化的質(zhì)粒dsDNA，體外轉(zhuǎn)錄的RNA，或者是體外合成的ssDNA[39]。目的基因與標(biāo)準(zhǔn)品在不同的反應(yīng)管內(nèi)同時進行擴增，使用的熒光材料可以是雜交探針、水解探針或是SYBR Green I。有研究表明[40]，這一方法的動力學(xué)范圍可以達到9個數(shù)量級，遠比終點法的要高。這一方法雖然簡便，但是為了得到可靠的實驗結(jié)果，有兩個先決條件必須等到滿足，一是所選用的標(biāo)準(zhǔn)品必須與目的基因的擴增效率一致，要達到這個要求，需要標(biāo)準(zhǔn)品同目的基因的同源性盡可能的高，不僅長度相似，而且其堿基組成也盡量相同；二是要盡可能地優(yōu)化實驗條件和模板的準(zhǔn)備過程。就標(biāo)準(zhǔn)品而言，實踐中有外參照和內(nèi)參照之分，作為外參照的標(biāo)準(zhǔn)品與目的基因不在同一反應(yīng)體系中進行擴增，所以它無法檢測也不可能補償可能出現(xiàn)在目的基因反應(yīng)體系中的影響因素，如PCR抑制子[41]。事實上，在絕大多數(shù)的實驗中，要想使標(biāo)準(zhǔn)品和目的基因的擴增效率完全一致是不可能的。為了彌補單獨使用一個標(biāo)準(zhǔn)品作為外參照的不足，研究者便引入一個內(nèi)參照同目的基因在同一反應(yīng)體系中同時進行擴增，以反映體系中可能出現(xiàn)的PCR影響因素，此即所謂的競爭性PCR。競爭性PCR 所使用的內(nèi)參照具有與目的基因序列相同的引物結(jié)合位點，但不具有相同的探針結(jié)合位點[42]。關(guān)于內(nèi)參照的設(shè)計，有多種方法可供選擇，例如向目的基因序列中引入插入或缺失突變[43]，改變目的基因中的某些核苷酸[44]，設(shè)計不同的限制性酶識別位點[45]，也可以用非特異的間隔基因或間隔DNA 作為內(nèi)參照[46]。競爭性PCR 設(shè)計的原理在于內(nèi)參照與目的基因相互競爭反應(yīng)的原料，所以兩者的量應(yīng)當(dāng)相互匹配，如果一方的拷貝數(shù)大大的高于另一方，那么拷貝數(shù)多的一方就會在反應(yīng)體系中得到優(yōu)先擴增，而拷貝數(shù)少的一方則擴增受到抑制，定量也就不能有效地進行。由于使用了內(nèi)對照，所以一旦體系中存在干擾PCR擴增的因素，就會通過內(nèi)對照的擴增效率的變化反映出來，目前使用的實時定量PCR儀都是以擴增曲線上crossing point的漂移來體現(xiàn)擴增效率的變化的。競爭性PCR 由于能夠消除反應(yīng)體系中干擾因素的影響，所以它所等到的結(jié)果要準(zhǔn)確可靠得多，但是由于在反應(yīng)體系中同時擴增兩種模板，使得其結(jié)果的測定范圍比單使用外參要大為縮小，往往只有2-3個數(shù)量級[40]。正是由于競爭性PCR 有利有辟，所以研究者應(yīng)根據(jù)不同的情況決定是否使用內(nèi)參照。
在目前的研究中，大多數(shù)研究者選擇使用絕對定量的方法，但是也有學(xué)者[47]認為在當(dāng)前的條件下，絕對定量具有難以克服的缺陷，主要包括:(1)制作一系列稀釋濃度的標(biāo)準(zhǔn)品不僅費時費力，而且也有相當(dāng)多的問題，目前廣泛使用的在260nm波長下定量的方法與眾多因素有關(guān)，如水、緩沖液、儀器性能，乃至于核酸的抽提過程都會影響到結(jié)果的穩(wěn)定性。（2）標(biāo)準(zhǔn)品的穩(wěn)定保存很難獲得成功，高濃度的核酸物質(zhì)易于被降解，而每次配制新的標(biāo)準(zhǔn)品又會增加批間差異。（3）每次測定樣本都要同時測定標(biāo)準(zhǔn)品，而熱循環(huán)儀的樣本孔往往有限，所以使得不能在單批內(nèi)測定更多的樣本，這樣也就使實時PCR 的高通量有所降低。（4）由于樣本來源存在極大的差異，所以很難保證標(biāo)準(zhǔn)品與目的基因的擴增效率一致。這樣會大大增加結(jié)果的變異，即使是各樣本的DNA（或cDNA）有極小的差異或模板片斷不均一，都會對定量的結(jié)果造成很大的差異。鑒于以上原因，這些學(xué)者強烈地推薦使用相對定量的方法，所謂相對定量是指在測定目的基因的同時測定某一內(nèi)源性管家基因，該管家基因的作用有（1）用于核苷酸的拷貝數(shù)的比較；（2）作為內(nèi)源性對照補償待測樣本的體積變異、核酸抽提過程中造成的目的基因變異，以及反映反應(yīng)體系內(nèi)是否存在PCR擴增的影響因素；（3）標(biāo)準(zhǔn)化標(biāo)本[47]。由于管家基因在各種組織中是恒定表達的，所以可以以管家基因的定量來作為某種標(biāo)準(zhǔn)以比較樣本來源不同的目的基因表達量的差異。通常選用的管家基因有GAPDH 、β-actin、β2-微球蛋白和rRNA，研究者也可以根據(jù)具體的需要而選定合適的管家基因。使用的相對定量較為早期的方法是用一系列已知外參物做標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)該標(biāo)準(zhǔn)曲線得到目的基因和管家基因的量，再將目的基因的同管家基因的比值作為定量的最后結(jié)果。這一方法要求外參、目的基因和管家基因的擴增效率一致。除了這種常用的方法之外，最近Livak和Schmittgen[48]設(shè)計了一種比較閾值法來測定目的基因的相對表達，他們根據(jù)數(shù)學(xué)推導(dǎo)得出目的基因的量=2-^^Ct，在該公式中，Ct是熱循環(huán)儀檢測到反應(yīng)體系中熒光信號的強度值，ΔΔCt=(Ct,目的基因-Ct,管家基因)實驗組-(Ct,目的基因-Ct,管家基因)對照，所以，2-^^Ct表示的是實驗組目的基因的表達相對于對照組的變化倍數(shù)，使用這一方法可以直接得到的目的基因相對于管家基因的定量，而不必制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，所以這一方法更為簡便省時。統(tǒng)計學(xué)結(jié)果表明這一方法的結(jié)果也是相當(dāng)可靠的。
總之，相對定量不僅比絕對定量更加簡單，經(jīng)濟（如果不做標(biāo)準(zhǔn)曲線），而且也更為可靠和準(zhǔn)確，因為存在于反應(yīng)體系中的干擾因素，如樣本不純、試劑影響等都可以通過數(shù)學(xué)處理而去除。
2. 重復(fù)性問題：重復(fù)性是判斷實驗結(jié)果優(yōu)劣的重要指標(biāo)，其主要判斷指標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)差（SD）和變異系數(shù)（CV）。對于特定的分析系統(tǒng)，重復(fù)性的高低決定了PCR反應(yīng)能檢測出樣本中目的基因的初始濃度變化的最小值。由于PCR反應(yīng)本身具有不精確擴增的特性，它所造成的結(jié)果精確性要遠小于經(jīng)典的臨床化學(xué)檢驗和免疫分析。對于絕大多數(shù)實驗，一般都可以計算出所設(shè)計體系能檢測出樣本初始濃度的最小值，根據(jù)多次實驗可以求得該最小值的變異情況和它的可信區(qū)間范圍，變異越小或是可信區(qū)間范圍越小，說明這一反應(yīng)體系的精確度越高。在實時定量PCR過程中，從樣本的準(zhǔn)備到擴增，再到定量的進行，實驗中的每個方面都與實驗的重復(fù)性息息相關(guān)，除了加樣的準(zhǔn)確性和實驗所選用的儀器固定參數(shù)的限制之外，影響結(jié)果重復(fù)性較為關(guān)鍵的因素還包括（1）PCR 反應(yīng)擴增的效率，如果在反應(yīng)體系中擴增效率不一致，就會影響到目的基因在單位時間內(nèi)的產(chǎn)量發(fā)生差異，從而影響到結(jié)果的穩(wěn)定，要解決這個問題，必須盡量優(yōu)化實驗條件，使反應(yīng)體系達到最佳擴增效率。（2）目的基因的初始濃度，初始拷貝數(shù)越低，結(jié)果的重復(fù)性越差，為了保證獲得精確的結(jié)果，應(yīng)使用初始濃度具有較高數(shù)量級的樣本，如果待測樣本中目的基因的量處于反應(yīng)體系的檢出限附近，那么最好是使用復(fù)孔以保證結(jié)果的可靠性。（3）標(biāo)準(zhǔn)曲線的影響，對于必須進行絕對定量的研究，標(biāo)準(zhǔn)曲線是必不可少的，雖然標(biāo)準(zhǔn)品和樣本之間的差異始終存在，但是制作一個好的標(biāo)準(zhǔn)曲線對定量結(jié)果至關(guān)重要，在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時，應(yīng)至少選擇5個稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品，涵蓋待測樣本中目的基因量可能出現(xiàn)的全部濃度范圍，理想的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)與樣本具有高同源性，最好是選擇純化的質(zhì)粒DNA 或是體外合成、轉(zhuǎn)錄的RNA（用于RT-PCR），在制備過程中，應(yīng)使用規(guī)范的步驟或是根據(jù)所購買的試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)操作手冊進行。
3. 敏感度問題：實時定量PCR 由于使用了熒光物質(zhì)作為定量的工具，使得其敏感性又大大地提高了，有人[47]報導(dǎo)實時定量PCR 的敏感性要高出傳統(tǒng)的終點定量PCR 大約250倍。在理論上，只要設(shè)計的引物對目的基因有足夠的特異性，PCR 應(yīng)可檢測出只含一個拷貝目的基因的樣本，也的確有人報導(dǎo)在特定的反應(yīng)條件下，實時定量PCR 可以檢測出單細胞水平的基因組DNA[11]，但是在大多數(shù)情況下，對基因組DNA而言，它的最低檢出限一般在pg到fg級，對于病毒、質(zhì)粒而言，其檢出限一般在102-103拷貝數(shù)以上[8]。影響實時定量PCR 敏感性的因素眾多，除了對一般PCR反應(yīng)均存在的影響因素如反應(yīng)體系、Taq酶的活性之外,實時定量PCR還有其特殊的影響因素，包括：
(1)反應(yīng)體系中形成的引物二聚體的影響：引物二聚體是非特異性退火和延伸的產(chǎn)物,它的形成不僅會影響到擴增的效率,而且由于SYBR Green I可以與所有的雙鏈DNA結(jié)合,所以會在反應(yīng)體系中出現(xiàn)特異性產(chǎn)物與引物二聚體競爭SYBR Green I的現(xiàn)象,從而降低了實時PCR的敏感性。要解決這個問題，有多種方案可供選擇，首先可以用水解探針代替SYBR Green I，雖然水解探針并不能消除引物二聚體的形成，但是在定量檢測時，它卻可以避開引物二聚體的干擾，專一地測定來自于特異產(chǎn)物的熒光信號，有文獻報導(dǎo)使用水解探針的敏感性要比SYBR Green I高出10倍。其次，可以使用熱啟動辦法，所謂熱啟動是指在反應(yīng)體系達到引物退火溫度時才加入某一反應(yīng)成分，因為引物二聚體的是在各種試劑一經(jīng)混合便開始形成的，所以用這種方法能有效地減少引物二聚體的形成，另外Lightcycler提供一種Taq酶的抗體，在PCR反應(yīng)的最初階段，這種抗體能阻斷Taq酶的作用，但是當(dāng)反應(yīng)溫度達到70度時，它便失活，使Taq酶開始發(fā)揮作用，在反應(yīng)體系中加入這一抗體的目的也就是使要在反應(yīng)達到較高溫度時，才開始PCR擴增，從而避免反應(yīng)初始階段引物二聚體的形成。第三，要盡可能地優(yōu)化引物設(shè)計，例如所設(shè)計的兩條引物不能互補（尤其在3’端），使兩條引物的GC含量大致一致，使用純化的引物進行實驗等，這些都是防止引物二聚體形成的根本因素。第四，如果反應(yīng)體系中出現(xiàn)PCR的抑制因素，應(yīng)適當(dāng)將目的基因的濃度稀釋后再進行擴增。最后，在實驗過程中應(yīng)當(dāng)注意避免室溫混合各種試劑，并且在一經(jīng)混合后立即開始進行擴增。
（2）循環(huán)數(shù)：一般的實時定量PCR反應(yīng)只須25－30個循環(huán)便可獲得滿意的結(jié)果，但是對于那些極微量的待測樣本而言，適當(dāng)增加循環(huán)數(shù)可以提高反應(yīng)的檢出限，有文獻報導(dǎo)當(dāng)循環(huán)數(shù)從25增加到34個循環(huán)時，實時定量PCR的最低檢出限可從106增加到103。但是并非循環(huán)數(shù)增加得越多，其敏感性就會越高，實際上，當(dāng)循環(huán)數(shù)增加到某一值時，敏感性便不再升高，因為循環(huán)數(shù)并不是影響敏感性的唯一因素，而且在實驗過程中，也不可能因為增加敏感性而無限制地增加循環(huán)數(shù)，這不僅是實踐中行不通，而且在理論上也不可行，因為隨著循環(huán)數(shù)的增加，一方面，聚積的產(chǎn)物會抑制Taq酶的活性，另一方面，也會增加形成異源二聚體的可能性，這些都會影響到最終的定量結(jié)果。
（3）Mg2＋的濃度：根據(jù)Roche公司的Lightcycler3.5版本技術(shù)說明，Mg2 的濃度將影響到實時定量PCR的敏感性，其推薦使用的濃度為3mM。Mg2 濃度對敏感性的影響主要存在于兩方面，首先，Mg2 是影響Taq酶活性的關(guān)鍵因素，如果Mg2 的濃度無法達到使Taq酶發(fā)揮最佳活性，無疑將會影響到實時定量的敏感性；其次，Mg2 的濃度過高，會增加引物二聚體的形成，從而導(dǎo)致敏感性降低。所以在反應(yīng)中選擇合適的Mg2 濃度條件，是相當(dāng)重要的。
