（一）在豐富培養(yǎng)基中擴(kuò)增質(zhì)粒
許多年來(lái)，一直認(rèn)為在氯霉素存在下擴(kuò)增質(zhì)粒只對(duì)生長(zhǎng)在基本培養(yǎng)基上的細(xì)菌有效，然而在帶有pＭＢl或ＣolEl復(fù)制子的高拷貝數(shù)質(zhì)粒的大腸桿菌菌株中，采用以下步驟可提高產(chǎn)量至每500ml培養(yǎng)物２－５mg質(zhì)粒ＤＮＡ，而且重復(fù)性也很好。
１）將30ml含有目的質(zhì)粒的細(xì)菌培養(yǎng)物培養(yǎng)到對(duì)數(shù)晚期（ＯＤ600約0.6)。培養(yǎng)基中應(yīng)含有相應(yīng)抗生素，用單菌落或從單菌落中生長(zhǎng)起來(lái)的小量液體閉關(guān)物進(jìn)行接種。
２）將含相應(yīng)抗生素的500ml ＬＢ或Terrific肉湯培養(yǎng)基（預(yù)加溫至37℃）施放入25ml對(duì)數(shù)晚期的培養(yǎng)物，于37℃劇烈振搖培養(yǎng)25小時(shí)（搖床轉(zhuǎn)速300轉(zhuǎn)/分），所得培養(yǎng)物的ＯＤ600值約為0.4。
３）可做可不做：加2.5ml氯霉素溶液（34mg/ml溶于乙醇）， 使終濃度為170μg/ml。像pBR322一類在宿主菌內(nèi)只以中等拷貝婁竿行復(fù)的質(zhì)粒，有必要通過(guò)擴(kuò)增。這些質(zhì)粒只要從生長(zhǎng)達(dá)到餉新一代的質(zhì)粒（如pUC質(zhì)粒）可復(fù)制達(dá)到很高的拷貝數(shù)，因此無(wú)需擴(kuò)增。這些質(zhì)粒只要從生長(zhǎng)達(dá)到飽和的細(xì)菌培養(yǎng)物即可大量提純。但用氯霉素進(jìn)行處理，具有抑制細(xì)菌復(fù)制的優(yōu)點(diǎn)，可減少細(xì)菌裂解物的體積和粘稠度，極大地簡(jiǎn)化質(zhì)粒純化的過(guò)程。所以一般說(shuō)來(lái)，盡管要在生長(zhǎng)中的細(xì)菌培養(yǎng)物里加入氯霉素略顯不便，但用氯霉素處理還是利大于弊。
４）于37℃劇烈振搖（300轉(zhuǎn)/分），繼續(xù)培養(yǎng)12-16小時(shí)。
（二）細(xì)菌的收獲和裂解
１．收獲
１）用Ｓorvall ＧＳ3轉(zhuǎn)頭（或與其相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)頭）于4℃以4000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，棄上清，敞開(kāi)離心管口并倒置離心管使上清全部流盡。
２）將細(xì)菌沉淀重懸于100ml用冰預(yù)冷的ＳＴＥ中。
STE
0.1mol/L NaCl
10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)
1mmol/L EDTA(pH8.0)
２）按步驟１）所述方法離心，以收集細(xì)菌細(xì)胞。
２．煮沸裂解法
該法[根據(jù)Ｈolmes和Ｑuigley(1981)的方法修訂而成] 可與隨后的純化步驟如氯化鈀－溴化乙錠梯度平衡離心等步驟聯(lián)合使用。建議該法只用于經(jīng)氯霉素處理的培養(yǎng)物，未處理的培養(yǎng)裂解后過(guò)于粘稠，不利操作。當(dāng)從大腸桿菌ＨＢ101或其衍生質(zhì)粒（包括ＴＧ1）中大量提取質(zhì)粒時(shí)，不宜采用煮沸法。這些細(xì)菌釋放大量糖類，在氯化銫－溴化乙錠梯度中與閉環(huán)ＤＮＡ形成密度大致相同的區(qū)帶。這些糖類還抑制以ＤＮＡ為模反或底物的酶。
１）將500ml 培養(yǎng)物的細(xì)菌沉淀物[ 從上述步驟３）獲得] 重懸于用冰預(yù)冷的10mlSTET中。
STET
0.1MOL/l nAcl
10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)
1mmol/L EDTA(pH8.0)
5% Triton X-100
將懸液移入50ml錐瓶中。
２）加入1ml新配制的溶菌酶溶液[10mg/ml,沉吟于10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)]。如溶液的pH值低于0.8溶菌酶不能有效地發(fā)揮作用。
３）用一個(gè)夾子把錐瓶放在本生燈的明火上加熱，直至液體恰好開(kāi)始沸騰，不停地?fù)u晃錐瓶。
４）立即把瓶浸入裝有沸水的大燒杯（2L）中，將瓶放在沸在水中，時(shí)間恰為4秒。
５）將瓶浸入用冰預(yù)次序的水中５分鐘，使之冷卻。
６）將粘稠狀內(nèi)容物從瓶中轉(zhuǎn)移到超離心管（Beckman SW41或與其相當(dāng)?shù)墓埽�，�?℃以30 000轉(zhuǎn)/分離心30分鐘。原有的細(xì)菌增減物生長(zhǎng)得越密，應(yīng)越難將粘稠狀裂解物轉(zhuǎn)移到離心管中。如有絕對(duì)必要，可用長(zhǎng)刀片和剪刀將裂解物剪成大小適于操作的大團(tuán)塊，或軸入10ml注射器的針筒中使之部分剪切。從經(jīng)用氯霉素處理的細(xì)菌培養(yǎng)物中分離質(zhì)粒ＤＮＡ?xí)r，一般不會(huì)出現(xiàn)這一問(wèn)題。如細(xì)菌碎片未能形成緊密的團(tuán)塊，可以35 000轉(zhuǎn)/分再度離心20分鐘， 然后盡可能將上清轉(zhuǎn)移到另一管內(nèi)，棄去殘存在管內(nèi)的粘稠狀液體。
７）將上清轉(zhuǎn)移到另一管內(nèi)，純化質(zhì)粒ＤＮＡ
３，ＳＤＳ裂解法
本法[根據(jù)Ｇodson和Ｖapnek(1973)的方法修訂而成]的產(chǎn)量要低得多，是提取大質(zhì)粒（大于15kb）的首選方法。
１）將來(lái)自500ml培養(yǎng)物的細(xì)菌沉淀物[來(lái)自收獲細(xì)菌的步驟３）] 洗過(guò)后重懸于10ml用冰預(yù)冷10%蔗糖、50mmol/L Tris.Cl(pH8.0)溶液中，將些懸液移至30ml的帶蓋螺口塑料試管[橡樹(shù)嶺（Oak Ridge)型]中。
２）加2ml新配制的溶菌酶溶液[10mg/ml,溶于10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)]。當(dāng)溶液的pH值小于8.0時(shí)，溶菌酶不能有效地發(fā)揮作用。
３）加8ml 0.25mol/L EDTA(pH8.0), 將管倒置數(shù)次以混勻懸液， 在冰上放置10分鐘。
４）加4ml 10% ＳＤＳ，馬上用一玻棒迅速混勻內(nèi)容物，使ＳＤＳ均勻分散到整個(gè)細(xì)菌懸液中，操作應(yīng)盡可能溫和小心，以便最大限度地避免釋放出來(lái)的ＤＮＡ受到剪切。
５）立即加入6ml 5mol/L NaCl（終濃度為1mol/L）， 再次用玻棒溫和地然而卻是徹底地混勻內(nèi)容物，在冰上放置至少１小時(shí)。
６）于4℃用Beckman Ti50型轉(zhuǎn)頭（或與其相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)頭）以30 000轉(zhuǎn)/分鐘，去掉高分子量ＤＮＡ和細(xì)菌碎片。小心將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)50ml的一次性塑料離心管中，棄去沉淀物。如果細(xì)菌碎片貼壁不緊，可用35 000轉(zhuǎn)/分再度離心20分鐘， 然后盡可能將上清轉(zhuǎn)移到另一管中，去掉存在離心管內(nèi)的粘稠狀液體。
７）上清用酚：氯仿和氯仿各抽提１次。
８）將水相轉(zhuǎn)移到－250nl的離心瓶中，于室溫加入２倍體積的（約60ml ）乙醇，充分混勻，于室溫放置1-2小時(shí)。
９）于４℃下以5000g離心20分鐘，回收核酸。
10）充上清，于室溫用70％乙醇洗滌沉淀物，按步驟９）離心，盡可能地去除乙醇，將離心管倒置于紙巾上，使最后殘存的乙醇流干，在真空干燥內(nèi)短時(shí)間干燥沉淀物，但不要使之完全干燥。
11）用3mlTE(pH8.0)溶解ＤＮＡ。
12）通過(guò)氯化銫－溴化乙錠梯度平衡離心純化質(zhì)粒ＤＮＡ。用聚乙二醇純化質(zhì)粒時(shí)，經(jīng)過(guò)幾次沉淀步驟，大質(zhì)粒（大于15kb）容易產(chǎn)生切口，所以氯化銫－溴化乙錠梯度平衡離心法是純化這種質(zhì)粒的首選方法。
４，堿裂解法
該法是Ｒ．Ｔreisman尚未發(fā)表的方法，同時(shí)也是Brinboim和Ｄoly(1979)及Ｉsh-Horowicz和Burke(1981)所用方法的改進(jìn)。該方法對(duì)于目前使用的所有大腸菌菌株都卓有成效，并可與隨后的純化步驟，如驟乙二醇沉淀或氯化銫－溴化乙錠梯度平衡離心等，一并聯(lián)合使用。注：括號(hào)中給出的體積可適用于未經(jīng)氯霉素處理的培養(yǎng)。
１）將冼過(guò)的500ml 培養(yǎng)物的細(xì)菌沉淀物[ 來(lái)自收獲細(xì)菌的步驟３）] 重懸于10ml（18ml
）溶液Ｉ中。
溶液Ｉ
50mmol/L葡萄糖
25mmol/L Tris.Cl(pH8.0)
10mmol/L EDTA(pH8.0)
溶液Ｉ可成批配制，在10 lbf/in2(6.895x104Pa)高壓下蒸氣滅菌15分鐘，貯存于４℃。
２）加1ml(2ml)新配制的溶菌酶溶液[10mg/ml,溶于10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)]。
當(dāng)溶液的pH值低于8.0時(shí)，溶菌酶不能有效工作。
３）加20ml(40ml)新配制的溶液Ⅱ。
溶液Ⅱ
0.2mol/L NaOH(臨用前用10mol/L貯存液現(xiàn)用現(xiàn)稀釋）
1％ＳＤＳ
蓋緊瓶蓋，緩緩顛倒離心瓶數(shù)次，以充分混勻內(nèi)容物。于室溫放置5-10分鐘。
４）加15nl(20ml)用冰預(yù)冷的溶液Ⅲ。
溶液Ⅲ
5mol/L乙酸鉀 60ml
冰乙酸 11.5ml
水 28.5ml
所配成的溶液對(duì)鉀是３mol/L，對(duì)乙酸根是5mol/L。
封住瓶口，搖動(dòng)離心瓶數(shù)次以混勻內(nèi)容物，此時(shí)應(yīng)不再出現(xiàn)分明的兩個(gè)液相。置冰上放10分鐘，應(yīng)形成一白色絮狀沉淀。于0℃放置后所形成的沉淀應(yīng)包括染體ＤＮＡ、 高分子量ＲＮＡ和鉀－ＳＤＳ－蛋白質(zhì)－膜復(fù)合物。
５）用ＳorvallＧＳ3轉(zhuǎn)頭（或與其相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)頭）于４℃以4000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，不開(kāi)剎車而使轉(zhuǎn)頭自然停轉(zhuǎn)。如果細(xì)菌碎片貼壁不緊，可以5000轉(zhuǎn)/分再度離心20分鐘， 然后盡可能將上清全部轉(zhuǎn)到另一瓶中，棄去殘留在離心管內(nèi)的粘稠狀液體。未能形成致密沉淀塊的原因通常是由于溶液Ⅲ與細(xì)菌裂解物混合不充分[步驟４）]。
６）用４層干酪包布把上清過(guò)濾至一250ml離心瓶中，加0.6體積的異丙醇，充分混勻，于室溫放置10分鐘。
７）用Ｓorvall GS3轉(zhuǎn)頭（或與其相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)頭）于室溫以500轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，回收核酸。如于４℃離心，鹽也會(huì)了生沉淀。
８）小心倒掉上清，敞開(kāi)瓶口倒置離心瓶使殘余上清液流盡，于室溫用70％乙醇洗滌沉積管壁。倒出乙醇，用與真空裝置相聯(lián)的巴期德吸出附于瓶壁的所有液滴，于室溫將瓶倒置放在紙巾上，使最后殘余的痕量乙醇揮殆盡。
９）用３ml TE(pH8.0)溶解核酸沉淀。
10）用氯化銫－溴化乙錠梯度平衡離心或聚乙二醇沉淀。
