（一）細(xì)菌的收獲和裂解
１．收獲
１）將2ml含相應(yīng)抗生素的ＬＢ加入到容量為15ml 并通氣良好（不蓋緊）的試管中，然后接入一單菌落，于30℃劇烈振搖下培養(yǎng)過夜。
２）將1.5ml培養(yǎng)物倒入微量離心管中，用微量離心機于4℃以12000g離心30秒，將剩余的培養(yǎng)物貯存于4℃。
３）吸去培養(yǎng)液，使細(xì)菌沉淀盡可能干燥。除去上清的簡便方法是用一次性使用的吸頭與真空管道相連，輕緩抽吸，并用吸頭接觸液面。當(dāng)液體從管中吸出時，盡可能使吸頭遠離細(xì)菌沉淀，然后繼續(xù)用吸頭通過抽真空除去附于管壁的液滴。
１．收獲
１）將2ml含相應(yīng)抗生素的ＬＢ加入到容量為15ml 并通氣良好（不蓋緊）的試管中，然后接入一單菌落，于30℃劇烈振搖下培養(yǎng)過夜。
２）將1.5ml培養(yǎng)物倒入微量離心管中，用微量離心機于4℃以12000g離心30秒，將剩余的培養(yǎng)物貯存于4℃。
３）吸去培養(yǎng)液，使細(xì)菌沉淀盡可能干燥。除去上清的簡便方法是用一次性使用的吸頭與真空管道相連，輕緩抽吸，并用吸頭接觸液面。當(dāng)液體從管中吸出時，盡可能使吸頭遠離細(xì)菌沉淀，然后繼續(xù)用吸頭通過抽真空除去附于管壁的液滴。
３．煮沸裂解
該法根據(jù)Ｈolmex和Quigley(1985)的方法改進而成。
１）將細(xì)菌沉淀[收獲細(xì)菌和步驟３）所得]重懸于350μlSTET中。
STET
0.1mol/L NaC
10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)
1mmol/L EDTA(pH8.0)
5% Triton X-100
２）加25μl新配制的溶菌酶溶液[10mg/ml,用10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)配制]，振蕩３秒鐘以混勻之。如果溶淮中pH低于8.0，溶菌酶就不能有效發(fā)揮作用。
３）將離心管放入煮沸的水浴中，時間恰為40秒。
４）用微量離心機于室溫以12 000g離心10分種。
５）用無菌牙簽從微量離心管中去除細(xì)菌碎片。
６）在上清中加入40μl 5mol/L乙酸鈉（pH5.2）和420μl異丙醇，振蕩混勻，于室溫放置５分鐘。
７）用微量離心機于4℃以12 000g離心５分種，回收核酸沉淀。
８）小心吸去上清液，將離心管倒置于一張紙巾上，以使所有液體流出。再將附于管壁的液滴除盡。除去上清的簡便方法是用一次性使用的吸頭與真空管道相連，輕緩抽吸，并用吸頭接觸液面。當(dāng)液體從管中吸出時，盡可能使吸頭遠離核酸沉淀，然后繼續(xù)用吸頭通過抽真空除去附于管的液滴。
９）加1ml７０％乙醇，于4℃以12 000g離心２分鐘。
10）按步驟８）所述再次輕輕地吸去上清，這一步操作要格外小心，因為有時沉淀塊貼壁不緊，去除管壁上形成的所有乙醇液滴，打開管口，放于室溫直至乙醇揮發(fā)殆盡，管內(nèi)無可見的液體（２－５）分鐘。
11）用50μl含無DNA酶的胰RNA酶（20μg/ml）的TE(pH8.0)溶解核酸稍加振蕩，貯存于-20℃。
i．當(dāng)從表達內(nèi)切核酸酶Ａ的大腸桿菌株（endA 株，如HB101 ）中小量制粒ＤＮＡ?xí)r，建議舍棄煮沸法。因為煮沸步驟不能完全滅活內(nèi)切核酸酶Ａ，以后在Ｍg2 存在下溫育（Ｖ中用限制酶時）質(zhì)粒ＤＮＡ可被降解。 在上述方案的步驟９）之間增加一步，即用酚：氯仿進行抽提，可以避免這一問題。
ii．此法制備的高考貝數(shù)質(zhì)粒（如Ｘf3哉pＵＣ），其產(chǎn)量一般約為：每毫升原細(xì)菌增減物３－５μg。
iii．如果要通過限酶切割反應(yīng)來分析ＤＮＡ，可�。�μlＤＮＡ溶液加到另一個含８μl水的微量離心管內(nèi)，加１μl 10x限制酶緩沖液和１單位所需限制酶，在適宜溫度溫育１－２小時。將剩余的ＤＮＡ貯存于－20℃。通過凝膠電泳分析經(jīng)限制酸消化的ＤＮＡ片段。如果小量制備的ＤＮＡ不被限制酶切開，很有可能在收獲細(xì)菌的步驟３）或上述步驟８）未能很好地去除所有液體。這種情況下，可用酚：氯仿抽提ＤＮＡ終產(chǎn)物，然后用乙醇重新沉淀ＤＮＡ，通常，用5－10倍過量的酶（特別是并不昂貴的酶）在100-200μl 體積中進行消化，可以克服限制酶切割反應(yīng)遇到切割反應(yīng)遇到的困難。消化后， 加0. 1 體積3mol/L乙酸鈉（pH5.2)和２倍體積乙醇沉淀ＤＮＡ。
（二）質(zhì)粒ＤＮＡ小量制備的問題與對策
裂解和煮佛法都極其可靠，重復(fù)性也很好，而且一般沒有會么麻煩。多年來，在我們實驗室中日常使用這兩種方法的過程中，只碰到過兩個問題：
１）有些工作者首次進行小量制備時，有時會發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒ＤＮＡ不能被限制酶所切割，這幾乎總是由于從細(xì)菌沉淀或從核酸沉淀中去除所有上清液時注意得不夠。大多數(shù)情況下，用酚：氯仿對溶液進行抽提可以去除小量備物中的雜質(zhì)。如果總是依然存在，可用離心柱層析注純化ＤＮＡ。
２）在十分偶然的情況下，個別小時制備物會出現(xiàn)無質(zhì)粒ＤＮＡ的現(xiàn)象。這幾乎肯定是由于核酸沉淀顆粒已同乙醇一起被棄去。
