扣除雜交又叫扣除cDNA克隆(subtractive cDNA cloning)，它是通過(guò)構(gòu)建扣除文庫(kù)(subtractive library)得以實(shí)現(xiàn)的。差別雜交對(duì)于因特殊處理而被誘發(fā)產(chǎn)生的mRNA之cDNA克隆的分離，或是在細(xì)胞中具高表達(dá)效率的mRNA之cDNA克隆的分離，無(wú)疑是一種有效的方法，但對(duì)于低豐度的mRNA之cDNA克隆的分離則有相當(dāng)?shù)睦щy。為了進(jìn)一步提高差別雜交的篩選效率，一種切實(shí)可行的辦法是構(gòu)建富含目的基因序列的cDNA文庫(kù)。應(yīng)用扣除雜交篩選法便可達(dá)到此種目的。
扣除雜交法的本質(zhì)是除去那些普遍共同存在的、或是非誘發(fā)產(chǎn)生的cDNA序列，從而使欲分離的目的基因的序列得到有效的富集，提高了分離的敏感性。下面以T細(xì)胞受體(T-cellreceptor，TCR有時(shí)亦稱之為T細(xì)胞抗原受體)編碼基因的分離為例子，說(shuō)明扣除雜交篩選法的基本原理與簡(jiǎn)要過(guò)程。T細(xì)胞和B細(xì)胞來(lái)自共同的前體細(xì)胞，兩者都能夠識(shí)別特異的抗原。但與B細(xì)胞不同，T細(xì)胞不能識(shí)別游離的抗原，而只能識(shí)別展現(xiàn)在其它細(xì)胞表面的抗原。T細(xì)胞的這種抗原識(shí)別特異性是由TCR基因決定的。
TCR基因只能在T細(xì)胞中表達(dá)，而不能在B細(xì)胞中表達(dá)。那么從T細(xì)胞mRNA制備來(lái)的單鏈cDNA，同大大超量的B細(xì)胞的mRNA在有利于發(fā)生DNA~RNA雜交的條件下保溫，其結(jié)果便會(huì)出現(xiàn)這樣的情況：所有的能夠在T和B兩類細(xì)胞中同時(shí)表達(dá)的T細(xì)胞基因的cDNA分子(約占98％)，都能與B細(xì)胞的mRNA退火形成DNA—RNA雜交分子，而不能在B細(xì)胞中表達(dá)的、T細(xì)胞特有的cDNA(約占2％)，由于B細(xì)胞中沒(méi)有相應(yīng)的mRNA，故不能形成DNA—RNA雜交分子，仍然處于單鏈的狀態(tài)。將此種雜交混合物通過(guò)羥基磷灰石柱(hydroxylapatitecolumn)，于是DNA—RNA雜交分子便結(jié)合在柱上，而游離的單鏈cDNA則過(guò)柱流出。如此回收到的T細(xì)胞特異的cDNA被轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈eDNA之后，與適當(dāng)?shù)?lambda;噬菌體載體重組井轉(zhuǎn)染給大腸桿菌寄主細(xì)胞，這樣便得到了T細(xì)胞特異eDNA高度富集的扣除文庫(kù)。然后再按照同樣方法制備扣除的eDNA探針，即被B細(xì)胞mRNA雜交扣除了的T細(xì)胞特異的cDNA探針，篩選文庫(kù)，結(jié)果成功地分離到了T細(xì)的TCR基因。
扣除雜交法同樣也可以用來(lái)分離缺失突變基因。從野生型植株制備的染色體總DNA，用一種適當(dāng)?shù)暮怂醿?nèi)切限制酶[比如Sau3A]切割成小片段。同時(shí)從缺失突變體植株制備的染色體總DNA，經(jīng)隨機(jī)切割之后，用生物素(biotin)進(jìn)行標(biāo)記，供作非同位素標(biāo)記探針使用。取大大超量的此種探針，同Sau3A酶切的野生型染色體總DNA片段混合，經(jīng)變性、退火處理，溶液中的無(wú)生物素標(biāo)記的野生型的DNA分子便同生物素標(biāo)記的突變型的DNA探針雜交。將雜交反應(yīng)混合物通過(guò)生物素結(jié)合蛋白質(zhì)柱(avidincolumn)。這種柱是用包裹著生物素結(jié)合蛋白質(zhì)的專用的細(xì)小磁珠裝填的。大部分野生型植株的DNA分子都同突變型植株的生物素標(biāo)記的DNA探針雜交，便被結(jié)合到柱上。而野生型植株的DNA片段月，由于在突變型DNA中缺失了相應(yīng)的片段，故沒(méi)有相應(yīng)的生物素標(biāo)記的探針與之雜交，經(jīng)洗脫便過(guò)柱流出。隨后將洗脫收集的DNA同超量的生物素標(biāo)記探針再雜交，再過(guò)柱。如此經(jīng)過(guò)多次重復(fù)富集之后，用PCR法擴(kuò)增DNA片段月，并予以克隆。最后用Southern雜交法進(jìn)一步鑒定出，只同野生型DNA雜交而不能同突變型DNA雜交的含有突變基因的陽(yáng)性克隆。
扣除雜交法的本質(zhì)是除去那些普遍共同存在的、或是非誘發(fā)產(chǎn)生的cDNA序列，從而使欲分離的目的基因的序列得到有效的富集，提高了分離的敏感性。下面以T細(xì)胞受體(T-cellreceptor，TCR有時(shí)亦稱之為T細(xì)胞抗原受體)編碼基因的分離為例子，說(shuō)明扣除雜交篩選法的基本原理與簡(jiǎn)要過(guò)程。T細(xì)胞和B細(xì)胞來(lái)自共同的前體細(xì)胞，兩者都能夠識(shí)別特異的抗原。但與B細(xì)胞不同，T細(xì)胞不能識(shí)別游離的抗原，而只能識(shí)別展現(xiàn)在其它細(xì)胞表面的抗原。T細(xì)胞的這種抗原識(shí)別特異性是由TCR基因決定的。
TCR基因只能在T細(xì)胞中表達(dá)，而不能在B細(xì)胞中表達(dá)。那么從T細(xì)胞mRNA制備來(lái)的單鏈cDNA，同大大超量的B細(xì)胞的mRNA在有利于發(fā)生DNA~RNA雜交的條件下保溫，其結(jié)果便會(huì)出現(xiàn)這樣的情況：所有的能夠在T和B兩類細(xì)胞中同時(shí)表達(dá)的T細(xì)胞基因的cDNA分子(約占98％)，都能與B細(xì)胞的mRNA退火形成DNA—RNA雜交分子，而不能在B細(xì)胞中表達(dá)的、T細(xì)胞特有的cDNA(約占2％)，由于B細(xì)胞中沒(méi)有相應(yīng)的mRNA，故不能形成DNA—RNA雜交分子，仍然處于單鏈的狀態(tài)。將此種雜交混合物通過(guò)羥基磷灰石柱(hydroxylapatitecolumn)，于是DNA—RNA雜交分子便結(jié)合在柱上，而游離的單鏈cDNA則過(guò)柱流出。如此回收到的T細(xì)胞特異的cDNA被轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈eDNA之后，與適當(dāng)?shù)?lambda;噬菌體載體重組井轉(zhuǎn)染給大腸桿菌寄主細(xì)胞，這樣便得到了T細(xì)胞特異eDNA高度富集的扣除文庫(kù)。然后再按照同樣方法制備扣除的eDNA探針，即被B細(xì)胞mRNA雜交扣除了的T細(xì)胞特異的cDNA探針，篩選文庫(kù)，結(jié)果成功地分離到了T細(xì)的TCR基因。
扣除雜交法同樣也可以用來(lái)分離缺失突變基因。從野生型植株制備的染色體總DNA，用一種適當(dāng)?shù)暮怂醿?nèi)切限制酶[比如Sau3A]切割成小片段。同時(shí)從缺失突變體植株制備的染色體總DNA，經(jīng)隨機(jī)切割之后，用生物素(biotin)進(jìn)行標(biāo)記，供作非同位素標(biāo)記探針使用。取大大超量的此種探針，同Sau3A酶切的野生型染色體總DNA片段混合，經(jīng)變性、退火處理，溶液中的無(wú)生物素標(biāo)記的野生型的DNA分子便同生物素標(biāo)記的突變型的DNA探針雜交。將雜交反應(yīng)混合物通過(guò)生物素結(jié)合蛋白質(zhì)柱(avidincolumn)。這種柱是用包裹著生物素結(jié)合蛋白質(zhì)的專用的細(xì)小磁珠裝填的。大部分野生型植株的DNA分子都同突變型植株的生物素標(biāo)記的DNA探針雜交，便被結(jié)合到柱上。而野生型植株的DNA片段月，由于在突變型DNA中缺失了相應(yīng)的片段，故沒(méi)有相應(yīng)的生物素標(biāo)記的探針與之雜交，經(jīng)洗脫便過(guò)柱流出。隨后將洗脫收集的DNA同超量的生物素標(biāo)記探針再雜交，再過(guò)柱。如此經(jīng)過(guò)多次重復(fù)富集之后，用PCR法擴(kuò)增DNA片段月，并予以克隆。最后用Southern雜交法進(jìn)一步鑒定出，只同野生型DNA雜交而不能同突變型DNA雜交的含有突變基因的陽(yáng)性克隆。
