代表性差示分析（RAD）充分發(fā)揮了PCR以指數(shù)形式擴增雙鏈模板，而以線性形式擴增單鏈模板的特性，通過消減和富集，使得目的基因片段得到特異性擴增。將待測cDNA (Tester)和驅(qū)動cDNA (Driver)分別用同一種識別4堿基序列的限制性內(nèi)切酶切割，形成的平均長度為256bp的cDNA片段代表群，保證了絕大多數(shù)遺傳信息均能被ＰＣＲ擴增；分別接上寡聚核苷酸接頭(adaptor)，并以接頭為引物進行PCR擴增，此步將大小不等的DNA片段分離純化；將接頭切除，并只在Tester片斷末端接上新接頭，然后將Tester與大大過量的Driver混合雜交。Driver過量的目的是使Ｔ群體中特異性序列沒有遺漏的可能；復(fù)性，補平末端，并以新接頭為引物進行ＰＣＲ擴增，形成的3種雜和體中只有自身退火形成的Tester / Tester兩端均能和引物配對，產(chǎn)物雙鏈ＤＮＡ數(shù)量呈指數(shù)遞增。Tester / Driver雜交體只能是單引物擴增，產(chǎn)物為單鏈ＤＮＡ分子，其數(shù)量呈線性遞增。Driver/ Driver雜和體由于分子兩端沒有與新引物配對區(qū)而無法進行擴增；用Mung Bean Nuclease去除單鏈DNA分子，差異雙鏈cDNA便完成第一輪富集。實驗中使用過量Driver DNA目的是充分使Tester DNA中和Driver DNA序列相同的片段雜交，酶解去除，只有差異雙鏈差異cDNA經(jīng)PCR幾輪循環(huán)得以有效富集。
代表性差示分析（RAD）優(yōu)點可以概括為以下幾個方面：
（1）引物設(shè)計十分巧妙
（2）可重復(fù)性好
（3）假陽性少
（4）mRNA用量少、特異性高
其缺點為：
（1）Tester組低豐度的分子自身雜交的幾率很低，所以被擴增和克隆的幾率仍很低；
（2）酶切連接步驟太多，cDNA會損失很多，所以可能漏掉關(guān)鍵基因；
（3）得到的不是cDNA全長而是其酶切片段。
