隨著分子生物學技術的發(fā)展，檢測基因結構和突變的方法不斷涌現(xiàn)。尤其是PCR技術問世以后，各種與PCR相結合的基因檢測技術進一步推動了基因研究的發(fā)展。如不對稱PCR產物的直接測序、核糖核酸酶酶切法(Ribonuclease cleavage，RNAase)、限制性片段長度多態(tài)性分析(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)等等已成為基因分析的有力工具.但這些方法操作比較繁瑣，局限性較大，或要求實驗條件高，不適合一般臨床實驗室使用.1989年問世的PCR-SSCP(下文稱SSCP)作為檢測基因突變的方法，經不斷地改進和完善，更為簡便、快速、靈敏，不但用于檢測基因點突變和短序列的缺失和插入，而且還被用于DNA定量分析，監(jiān)測PCR診斷實驗中的交叉污染情況，以及傳染源的調查等.由于SSCP的突出的優(yōu)點，近幾年被大量地應用.
一、SSCP的原理及特點
日本Orita等研究發(fā)現(xiàn)，單鏈DNA片段呈復雜的空間折疊構象，這種立體結構主要是由其內部堿基配對等分子內相互作用力來維持的，當有一個堿基發(fā)生改變時，會或多或 少地影響其空間構象，使構象發(fā)生改變，空間構象有差異的單鏈DNA分子在聚丙烯酰 胺凝膠中受排阻大小不同.因此，通過非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，可以非常 敏銳地將構象上有差異的分子分離開.作者稱該方法為單鏈構象多態(tài)性 (Single-Strand Conformation Polymorphism，SSCP)分析.在隨后的研究中，作者又 將SSCP用于檢查PCR擴增產物的基因突變，從而建立了PCR-SSCP技術，進一步提高了檢測突變方法的簡便性和靈敏性.其基本過程是:①PCR擴增靶DNA;②將特異的PCR擴增 產物變性，而后快速復性，使之成為具有一定空間結構的單鏈DNA分子;③將適量的單 鏈DNA進行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳;④最后通過放射性自顯影、銀染或溴化乙錠顯色分析結果.若發(fā)現(xiàn)單鏈DNA帶遷移率與正常對照的相比發(fā)生改變，就可以判定該鏈構 象發(fā)生改變，進而推斷該DNA片段中有堿基突變.該方法簡便、快速、靈敏，不需要特 殊的儀器，適合臨床實驗的需要.但它也有不足之處.例如，只能作為一種突變檢測方 法，要最后確定突變的位置和類型，還需進一步測序;電泳條件要求較嚴格;另外，由于SSCP是依據點突變引起單鏈DNA分子立體構象的改變來實現(xiàn)電泳分離的，這樣就可能會出現(xiàn)當某些位置的點突變對單鏈DNA分子立體構象的改變不起作用或作用很小 時，再加上其他條件的影響，使聚丙烯酰胺凝膠電泳無法分辨造成漏檢.盡管如此該 方法和其他方法相比仍有較高的檢測率.首先，它可以發(fā)現(xiàn)靶DNA片段中未知位置的堿 基突變.Takao，經實驗證明小于300bp的DNA片段中的單堿基突變，90%可被SSCP發(fā) 現(xiàn)，他認為現(xiàn)在知道的所有單堿基改變絕大多數(shù)可用該方法檢測出來.另外，SSCP方 法可通過聚丙烯酰胺凝膠電泳將不同遷移率的突變單鏈DNA分離，并且還可以進一步 提純.用這種方法可以最終從DNA序列水平上鑒別突變DNA片段.
二、SSCP的改進
SSCP技術自創(chuàng)立以來，經歷了自身發(fā)展和完善的過程，剛建立時是將同位素摻入PCR 擴增物中，通過放射自顯影來顯示結果.這給該技術的推廣造成一定的困難，隨著DNA 銀染方法與PCR-SSCP結合，尤其是直接溴乙錠染色方法的應用，使得該方法大大簡化.最近，SSCP值得注意的改進是將DNA-SSCP分析，改為RNA-SSCP分析,其基本原理是: RNA有著更多精細的二級和三級構象，這些構象對單個堿基的突變很敏感，從而提高 了檢出率，其突變檢出率可達90%以上.另外，RNA不易結合成雙鏈，因此可以較大量 的進行電泳，有利于用溴化乙錠染色.但該方法增加了一個反轉錄過程;還需要一個較長的引物，內含有啟動RNA聚合酶的啟動序列，從而相對地增加了該方法的難度.
為了進一步提高SSCP的檢出率，可將SSCP分析與其它突變檢測方法相結合.其中與雜 交雙鏈分析(Heterocluplex analysis，Het)法結合可以大大提高檢出率.Het法是用 探針與要檢測的單鏈DNA或RNA進行雜交，含有一對堿基對錯配的雜交鏈可以和完全互 補的雜交鏈在非變性PAG凝膠上通過電泳被分離開.對同一靶序列分別進行SSCP和Het 分析可以使點突變的檢出率接近100%，而且實驗簡便.
三、PCR-SSCP的實驗操作
在小于1Kb長度的情況下，DNA片段長度與丙烯酰胺的濃度選擇如下:
DNA片段長度(核苷酸數(shù)) 丙烯酰胺(%)
1Kb～700b 3.5
700b～500b 5
500b～200b 8
200b 12
在進行SSCP前首先要通過PCR擴增出特異性好的產物(瓊脂糖電泳不能有過強的拖尾).
1)制備聚丙烯酰胺凝膠(PAG)
按上表制所需的膠液，將梳子插入模子，從梳子一端加入膠，當膠液快到梳齒時，使 模子向加膠端傾斜，繼續(xù)慢慢加膠，邊加邊放端模子以防止氣泡形成，室溫放置1h使 之凝固.然后拔掉梳子，頂部加入1×TBE封閉，備用.
2)電泳
取10μlPCR產物，加入10μl變性劑(95%甲酰胺，10mmol/LEDTA，0.02%溴酚藍)、30μl 石蠟油，煮沸5min，取出立刻放入冰浴中2min以上，然后將水相全部上樣，10-15℃下 電泳.開始在300V電壓下電泳5min，然后在120V電泳8h，取下凝膠，將其浸在含 0.5ug/ml溴化錠的1×TBE緩沖液中染色30--45min，在紫外燈下觀察，或進行銀染.
3)銀染法
將PAG板用去離子水洗二次，浸入10%乙醇和0.5%冰醋酸溶液固定6min.用去離子水洗 二次，再浸入0.2%AgNO3溶液中10min.用去離子水洗3--5次，然后浸入1.5%NaOH和 0.4%甲醛溶液中顯色7min.最后，用0.75%NaCO3終止顯色.
四、SSCP的應用
自從Orita等用SSCP進行人類DNA多態(tài)性分析以來，該方法大量地用于檢測和腫瘤發(fā)生 有關的基因突變，例如檢測星形細胞瘤、腦瘤、小細胞肺癌、胃癌、腸癌等腫瘤中的 p53基因的突變、肺癌的ras基因突變等.最近Sugano等用銀染色SSCP法，成功地檢測 了c-Ki-ras2基因第12位的突變，電泳和銀染色過程在2.5小時內完成.SSCP還用于檢 測引起人類遺傳性疾病的研究上，如在囊性纖維化中起作用的CFTR基因、神經纖維瘤 1型基因、家族性結腸息肉基因的研究中.最近，Sharkar等用RNA-SSCP法檢測了28名B 型血友病患者的凝血因子IX的基因序列，并與DNA-SSCP和直接基因測序法進行了比 較，發(fā)現(xiàn)在全長2.6kbp的凝血因子IX基因組中，有20處堿基點突變，RNA-SSCP可檢測 出其中的70%，而DNA-SSCP只能檢測出35%，顯示了RNA-SSCP比DNA-SSCP有更高的靈敏 性.
SSCP法除大量地用于基因突變的檢測外，還用于病毒的分型、監(jiān)測PCR實驗中的污染 情況、以及病原體傳播途徑的研究中.Yap用巢式PCR對來自不同國家和地區(qū)的HBV標品 進行了檢測，并對擴增產物進行了SSCP分析，發(fā)現(xiàn)每個標本的SSCP圖譜完全不同，不 僅證明了HBVDNA具有地區(qū)性變異，而且排除了交叉性污染的可能性，為保證PCR診斷 結果的可靠性找到了好方法.另外，Yap等還將SSCP用于DNA定量分析上，他們將SSCP 與競爭性PCR法相結合進行乳腺癌細胞突變p53基因的定量分析，并取得了初步成功. 該方法的優(yōu)點在于，內標和待測DNA只有一個堿基不同，這樣使內標和待測DNA有相同 的擴增條件，從而更準確地測出DNA的量.從以上可以看出，SSCP正在分子生物學領域 發(fā)揮著巨大的作用.
五、SSCP注意的事項
SSCP是一種快速、簡便、靈敏的檢測基因突變的方法，為了使SSCP達到最佳效果，應 注意下列事項.
①重復性.影響SSCP重復性的主要因素為電泳的電壓和溫度.這兩個條件保持不變， SSCP圖譜可保持良好的重復性.一般SSCP圖譜是二條單鏈DNA帶，但有時有的DNA片段 可能只呈現(xiàn)一條SSDNA帶，或者三條以上，這主要是由于兩條單鏈DNA之間存在相似的 立體構象.有時三條以上的SSCP圖譜是由于野型DNA片段和突變型DNA片段共同存在的 結果.
②靶DNA序列長度的影響在實驗中發(fā)現(xiàn)SSCP對短鏈DNA或RNA的點突變檢出率要比長鏈 的高，這可能是由于長鏈DNA和RNA分子中單個堿基的改變在維持立體構象中起的作用 較小的緣故.而有人認為在DNA鏈較短的(400bp以下)情況下，DNA的長度不會影響SSCP 的效果.他們仔細選擇了實驗條件，發(fā)現(xiàn)354bp的DNA中點突變的檢出率仍可達到90%以 上.
�、垭娪倦妷汉蜏囟鹊挠绊�:為了使單鏈DNA保持一定的穩(wěn)定立體構象，SSCP應在較低溫 度下進行(一般4℃-15℃之間).在電泳過程中除環(huán)境溫度外，電壓過高也是引起溫度 升高的主要原因，因此，在沒有冷卻裝置的電泳槽上進行SSCP時，開始的5min應用較 高的電壓(250V)，以后用100V左右電壓進行電泳.這主要是由于開始的高電壓可以使 不同立體構象的單鏈DNA初步分離，而凝膠的溫度不會升高.隨后的低電壓電泳可以使 之進一步分離.在實驗中應根據具體實驗條件確定電泳電壓.
�、蹹NA片段中點突變的位置對SSCP的影響點突變在DNA和RNA中的位置對SSCP檢測率的 影響，取決于該位置對維持立體構象作用的大小，而不是僅僅取決于點突變在DNA鏈 上的位置(有人認為點突變在DNA鏈中部要比在近端部容易被SSCP檢測出來).White曾 設計了一組樣品DNA片段，并將其中的點突變設在DNA鏈的中部，而且該點又正處在發(fā) 夾結構頂端的環(huán)上，結果發(fā)現(xiàn)SSCP只能檢測出9個樣品中的2個(檢出率為22%)，說明 DNA鏈中任何部位的突變，只要對其單鏈立體構象沒有影響，都有可能被漏檢.
�、軸SCP的結果斷定:由于在SSCP分析中非變性PAG電泳不是根據單鏈DNA分子和帶電量 的大小來分離的，而是以單鏈DNA片段空間構象的立體位阻大小來實現(xiàn)分離的，因 此，這種分離不能反映出分子量的大小.有時正常鏈與突變鏈的遷移率很接近，很難 看出兩者之間的差別.因此一般要求電泳長度在16--18cm以上，以檢測限為指標來判 定結果.檢測限是指突變DNA片段與正常DNA片段可分辨的電泳距離差的最小值.大于檢 測限則判定鏈的遷移率有改變，說明該DNA序列有變化，小于檢測限則說明鏈之間無 變化.例如，一般檢測限定為3mm，那么當兩帶間距離在3mm以上，則說明兩鏈之間有 改變.另外檢測限不能定的太低，否則主觀因素太大，易造成假陽性結果.另外，SSCP 分析中其它條件，如PCR產物的上樣量，PAG的交聯(lián)度、以及膠的濃度等，都應根據具 體實驗進行選擇確定.總之，SSCP分析法是一種快速、簡便、靈敏的突變檢測方法， 適合臨床實驗室的要求.它可以檢測各種點突變，短核苷酸序列的缺失或插入.隨著 SSCP分析不斷完善，它將成為基因診斷研究的一個有力工具.
