摘要 綜述了包涵體形成、包涵體分離和溶解、包涵體折疊復(fù)性的方法、復(fù)性產(chǎn)率低下的主要因素以及通過分子伴侶、低分子量添加物等的應(yīng)用而提高了蛋白質(zhì)復(fù)性產(chǎn)率。
關(guān)鍵詞 包涵體 蛋白質(zhì) 復(fù)性
Abstract Strategies for decreasing the formation of inclusion bodies, isolation and resolution of inclusion bodies, refolding of inclusion body proteins and the cause of decreased refolding yields were included. Renaturation yield of recombinant protein have been improved by using some additives, such as molecular chaperone, small molecules.
Key words inclusion body , protein , renaturation
外源基因在大腸桿菌中的高表達(dá)常常導(dǎo)致包涵體的形成，雖然包涵體具有富集目標(biāo)蛋白質(zhì)、抗蛋白酶、對宿主毒性小等優(yōu)點，但包涵體蛋白質(zhì)的復(fù)性率一般都很低,而分子伴侶、低分子量添加物等在復(fù)性過程中的應(yīng)用及新的復(fù)性方法的建立都大大提高了重組蛋白質(zhì)復(fù)性產(chǎn)率。
一、包涵體：
1.1包涵體的定義、組成與特性：
包涵體是指細(xì)菌表達(dá)的蛋白在細(xì)胞內(nèi)凝集，形成無活性的固體顆粒。 一般含有50%以上的重組蛋白，其余為核糖體元件、RNA聚合酶、內(nèi)毒素、外膜蛋白o(hù)mpC、ompF和ompA等，環(huán)狀或缺口的質(zhì)粒DNA，以及脂體、脂多糖等，大小為0.5-1um，具有很高的密度（約1.3mg/ml），無定形，呈非水溶性，只溶于變性劑如尿素、鹽酸胍等。NMR等新技術(shù)的應(yīng)用表明包涵體具有一定量的二級結(jié)構(gòu)，他們可能在復(fù)性的啟動階段中具有一定的作用。[1]
1.2包涵體的形成：
主要因為在重組蛋白的表達(dá)過程中缺乏某些蛋白質(zhì)折疊的輔助因子，或環(huán)境不適，無法形成正確的次級鍵等原因形成的。
1.2.1、基因工程菌的表達(dá)產(chǎn)率過高，超過了細(xì)菌正常的代謝水平，由于細(xì)菌的δ因子的蛋白水解能力達(dá)到飽和，使之表達(dá)產(chǎn)物積累起來。研究發(fā)現(xiàn)在低表達(dá)時很少形成包涵體，表達(dá)量越高越容易形成包涵體。原因可能是合成速度太快，以至于沒有足夠的時間進(jìn)行折疊，二硫鍵不能正確的配對，過多的蛋白間的非特異性結(jié)合，蛋白質(zhì)無法達(dá)到足夠的溶解度等。
1.2.2、重組蛋白的氨基酸組成：一般說含硫氨基酸越多越易形成包涵體，而脯氨酸的含量明顯與包涵體的形成呈正相關(guān)。
1.2.3、重組蛋白所處的環(huán)境：發(fā)酵溫度高或胞內(nèi)pH接近蛋白的等電點時容易形成包涵體。
1.2.4、重組蛋白是大腸桿菌的異源蛋白，由于缺乏真核生物中翻譯后修飾所需酶類和輔助因子，如折疊酶和分子伴侶等，致使中間體大量積累，容易形成包涵體沉淀。
1.2.5、蛋白質(zhì)在合成之后，于中性pH或接近中性pH的環(huán)境下，其本身固有的溶解度對于包涵體的形成比較關(guān)鍵，即是說，有的表達(dá)產(chǎn)率很高，如Aspartase和Cyanase,表達(dá)產(chǎn)率達(dá)菌體蛋白的30%,也不形成包涵體，而以可溶形式出現(xiàn)。[2]
1.2.6、在細(xì)菌分泌的某個階段，蛋白質(zhì)分子間的離子鍵、疏水鍵或共價鍵等化學(xué)作用導(dǎo)致了包涵體的形成。
1.3包涵體破菌、分離、洗滌及溶解
1.3.1基因工程菌發(fā)酵液，經(jīng)離心濃縮后，可用：機(jī)械破碎、超聲破碎：單純超聲破碎，在小規(guī)模下且菌量較少的情況下效果較好，由于能量傳遞和局部產(chǎn)熱等原因，很難用于大體積細(xì)胞懸液的破碎，這樣部分未破碎細(xì)胞與包涵體混在一起，給后期純化帶來困難。因此，在較大規(guī)模純化時先用溶菌酶破碎細(xì)菌的細(xì)胞膜，再結(jié)合超聲破碎方法，可顯著提高包涵體的純度和回收率。以及化學(xué)方法破碎使細(xì)菌裂解,然后以5000-20000g 15min離心，可使大多數(shù)包涵體沉淀，與可溶性蛋白分離。
1.3.2洗滌：為了除去包涵體上粘附的雜質(zhì)，如膜蛋白或核酸，應(yīng)用洗滌液洗滌包涵體，通常用低濃度的變性劑,過高濃度的尿素或鹽酸胍會使包涵體溶解，如2M尿素在50mM Tris pH7.0-8.5左右,1mM EDTA中洗滌。此外可以用溫和去垢劑TritonX-100洗滌去除膜碎片和膜蛋白。[3]
1.3.3溶解：一般用強(qiáng)的變性劑如尿素（6-8M）、鹽酸胍（GdnHCl 6M），通過離子間的相互作用，打斷包涵體蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間的各種化學(xué)鍵，使多肽伸展，一般來講，鹽酸胍優(yōu)于尿素，因為鹽酸胍是較尿素強(qiáng)的變性劑，它能使尿素不能溶解的包涵體溶解，而且尿素分解的異氰酸鹽能導(dǎo)致多肽鏈的自由氨基甲酰化，特別是在堿性pH值下長期保溫時�；蛴萌ス竸鏢DS、正十六烷基三甲基銨氯化物、Sarkosyl等，可以破壞蛋白內(nèi)的疏水鍵，也可溶解一些包涵體蛋白質(zhì)。Kandula Suntha等人用TritonX-100來溶解Zymononas mobilis levansucrase包涵體蛋白。另外，對于含有半胱氨酸的蛋白質(zhì)，分離的包涵體中通常含有一些鏈間形成的二硫鍵和鏈內(nèi)的非活性二硫鍵。還需加入還原劑，如巰基乙醇、二硫基蘇糖醇（DTT）、二硫赤蘚糖醇、半胱氨酸。還原劑的使用濃度一般是50-100mM 2-BME或DTT，也有文獻(xiàn)使用5mM濃度。在較粗放的條件下，可以使用5ml/l的濃度。還原劑的使用濃度與蛋白二硫鍵的數(shù)目無關(guān)，而有些沒有二硫鍵的蛋白加不加還原劑無影響，如牛生長激素包涵體的增溶。對于目標(biāo)蛋白沒有二硫鍵某些包涵體的增溶，有時還原劑的使用也是必要的，可能由于含二硫鍵的雜蛋白影響了包涵體的溶解。[4]
二、復(fù)性：
由于包涵體中的重組蛋白缺乏生物學(xué)活性，加上劇烈的處理條件，使蛋白的高級結(jié)構(gòu)破壞，因此重組蛋白的復(fù)性特別必要。 通過緩慢去除變性劑使目標(biāo)蛋白從變性的完全伸展?fàn)顟B(tài)恢復(fù)到正常的折疊結(jié)構(gòu)，同時去除還原劑使二硫鍵正常形成。一般在尿素濃度4M左右時復(fù)性過程開始，到2M 左右時結(jié)束。對于鹽酸胍而言，可以從4M開始，到1.5M 時復(fù)性過程已經(jīng)結(jié)束。
2.1包涵體蛋白復(fù)性方法
2.1.1稀釋復(fù)性：直接加入水或緩沖液，放置過夜，缺點是體積增加較大，變性劑稀釋速度太快，不易控制。目前稀釋法主要有一次稀釋、分段稀釋和連續(xù)稀釋三種方式。
2.1.2透析復(fù)性：好處是不增加體積，通過逐漸降低外透液濃度來控制變性劑去除速度，有人稱易形成無活性蛋白質(zhì)聚體，且不適合大規(guī)模操作，無法應(yīng)用到生產(chǎn)規(guī)模。
2.1.3超濾復(fù)性：在生產(chǎn)中較多的使用，規(guī)模較大，易于對透析速度進(jìn)行控制，缺點是不適合樣品量較少的情況，且有些蛋白可能在超濾過程中不可逆的變性。
2.1.4柱上復(fù)性：是最近研究較多并成功的在生產(chǎn)中應(yīng)用的一種復(fù)性方法，包涵體蛋白變性后，在色譜柱上復(fù)性，大致可分成疏水柱復(fù)性及凝膠柱復(fù)性兩類。其中的凝膠柱復(fù)性均是用Sephacry1S-100或Superdex75 等分子篩填料，柱較長（40cm-100cm不等）。相比稀釋和透析兩種方法，色譜柱復(fù)性回收率高（高達(dá)90%以上）、快速、易放大，樣品稀釋倍數(shù)�。ㄒ话阄灞蹲笥遥5]
2.1.5高蛋白質(zhì)濃度下的復(fù)性：通常有兩種方法，一是緩慢地連續(xù)或不連續(xù)地將變性蛋白加入到復(fù)性緩沖液中，使得蛋白質(zhì)在加入過程中或加入階段之間有足夠的時間進(jìn)行折疊復(fù)性；二是采用溫度跳躍式復(fù)性，即讓蛋白質(zhì)先在低溫下折疊復(fù)性以減少蛋白質(zhì)聚集的形成，當(dāng)形成聚集體的中間體已經(jīng)減少時，迅速提高溫度以促進(jìn)蛋白質(zhì)折疊復(fù)性。
此外，吸附法、反膠束法和雙水相萃取法等都可用蛋白質(zhì)的復(fù)性。
2.2包涵體蛋白復(fù)性效率
復(fù)性是一個非常復(fù)雜的過程，除與蛋白質(zhì)復(fù)性的過程控制相關(guān)外，還很大程度上與蛋白質(zhì)本身的性質(zhì)有關(guān)，有些蛋白非常容易復(fù)性，如牛胰RNA酶有12對二硫鍵，在較寬松的條件下復(fù)性效率可以達(dá)到95%以上，而有一些蛋白至今沒有發(fā)現(xiàn)能夠?qū)ζ溥M(jìn)行復(fù)性的方法如IL-11，很多蛋白的復(fù)性效率只有百分之零點幾，如在純化IL-2時以十二烷基硫酸鈉溶液中加入銅離子（0.05%SDS，7.5-30u mol/l CuCl2）的方法，25-37°C下反應(yīng)3小時，再EDTA至1m mol/l終止反應(yīng)，復(fù)性后的二聚體低于1%。[6]一般說來，蛋白質(zhì)的復(fù)性效率在20%左右。
2.2.1影響復(fù)性效率的因素：
2.2.1.1蛋白質(zhì)的復(fù)性濃度：正確折疊的蛋白質(zhì)的得率低通常是由于多肽鏈之間的聚集作用，蛋白質(zhì)的濃度是使蛋白質(zhì)聚集的主要因素，因而，一般濃度控制在0.1-1mg/ml；如果變性蛋白加入復(fù)性液中過快，容易形成絮狀沉淀，可能是蛋白重新凝聚的緣故。所以我們采用再水浴和磁力攪拌下，逐滴加入變性蛋白，使變性蛋白在復(fù)性液中始終處于低濃度狀態(tài)。
2.2.1.2pH和溫度：復(fù)性緩沖液的pH值必須在7.0以上，這樣可以防止自由硫醇的質(zhì)子化作用影響正確配對的二硫鍵的形成，過高或過低會降低復(fù)性效率，最適宜的復(fù)性pH值一般是8.0-9.0。[12]
此外，影響復(fù)性效率的因素還有，變性劑的起始濃度和去除速度、氧化還原電勢、離子強(qiáng)度、共溶劑和其他添加劑的存在與否等。
2.2.2提高包涵體蛋白的復(fù)性產(chǎn)率
2.2.2.1氧化-還原轉(zhuǎn)換系統(tǒng)
對于含有二硫鍵的蛋白，復(fù)性過程應(yīng)能夠促使二硫鍵形成。常用的方法有：空氣氧化法、使用氧化交換系統(tǒng)、混合硫化物法、谷胱甘肽再氧化法及DTT再氧化法.
最常用的氧化交換系統(tǒng)是GSH/GSSG,而cysteine/cystine、cysteamine/cystamine、DTT/GSSG、DTE/GSSG等也都有應(yīng)用。氧化交換系統(tǒng)通過促使不正確形成的二硫鍵的快速交換反應(yīng)提高了正確配對的二硫鍵的產(chǎn)率。通常使用1-3m mol/l還原型巰基試劑,還原型和氧化型巰基試劑的比例通常為10：1—5：1。[7]
2.2.2.2添加低分子化合物
低分子化合物自身并不能加速蛋白質(zhì)的折疊，但可能通過破壞錯誤折疊中間體的穩(wěn)定性，或增加折疊中間體和未折疊分子的可溶性來提高復(fù)性產(chǎn)率。如鹽酸胍、脲、烷基脲、以及碳酸酰胺類等，在非變性濃度下是很有效的促進(jìn)劑。蛋白質(zhì)的輔因子、配基或底物亦可起到很好的促折疊作用，如蛋白質(zhì)的輔因子Zn2 或Cu2 可以穩(wěn)定蛋白質(zhì)的折疊中間體,從而防止了蛋白質(zhì)的聚集，加入濃度大于0.4 mol/lTris緩沖液可提高包涵體蛋白質(zhì)的折疊效率。濃度為0.4-0.6M L-Arg有助于增加復(fù)性中間產(chǎn)物的溶解度。成功的應(yīng)用于很多蛋白如t-PA的復(fù)性中，可以抑制二聚體的形成。
NDSBs是近年來出現(xiàn)的可促進(jìn)蛋白復(fù)性的新家族, NDSBs由一個親水的硫代甜菜堿及一個短的疏水集團(tuán)組成，故不屬于去垢劑,不會形成微束,易于透析去除，目前，常用的有NDSB-195，NDSB-201，NDSB-256。[8]
2.2.2.3PEG-NaSO4兩相法
用PEG和NaSO4作為成相劑,然后加入鹽酸胍，再把變性的還原的蛋白質(zhì)溶液加入其中進(jìn)行復(fù)性,但這種方法需復(fù)性的變性蛋白質(zhì)的濃度必須低。[9]
2.2.2.4分子伴侶和折疊酶等
這類蛋白質(zhì)主要包括硫氧還蛋白二硫鍵異構(gòu)酶、肽酰-輔氨酰順反異構(gòu)酶、分子伴侶、FK506結(jié)合蛋白、Cyclophilin等。分子伴侶和折疊酶等不僅可在細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的折疊和聚集過程的平衡，而且可在體外促進(jìn)蛋白質(zhì)的折疊復(fù)性。[13]
2.2.2.5其它
提高復(fù)性率的策略還有許多，如：非離子型去垢劑，尤其是離子型或兩性離子去垢劑或表面活性劑CHAPs、Triton X-100、磷脂、laury lmaltosid、Sarkosyl等對蛋白質(zhì)復(fù)性有促進(jìn)作用；待折疊復(fù)性的蛋白質(zhì)的抗體可有效協(xié)助其復(fù)性；多聚離子化合物如肝素不僅可以促進(jìn)蛋白質(zhì)的作用，而且具有穩(wěn)定天然蛋白質(zhì)的作用。[10]
2.3復(fù)性效果的檢測：
根據(jù)具體的蛋白性質(zhì)和需要，可以從生化、免疫、物理性質(zhì)等方面對蛋白質(zhì)的復(fù)性效率進(jìn)行檢測。
2.3.1、凝膠電泳：一般可以用非變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳可以檢測變性和天然狀態(tài)的蛋白質(zhì)，或用非還原的聚丙烯酰胺電泳檢測有二硫鍵的蛋白復(fù)性后二硫鍵的配對情況。
2.3.2、光譜學(xué)方法：可以用紫外差光譜、熒光光譜、圓二色性光譜（CD）等，利用兩種狀態(tài)下的光譜學(xué)特征進(jìn)行復(fù)性情況的檢測，但一般只用于復(fù)性研究中的過程檢測。
2.3.3、色譜方法：如IEX、RP-HPLC、CE等，由于兩種狀態(tài)的蛋白色譜行為不同，
2.3.4、生物學(xué)活性及比活測定：一般用細(xì)胞方法或生化方法進(jìn)行測定，較好的反映了復(fù)性蛋白的活性，值得注意的是，不同的測活方法測得的結(jié)果不同，而且常常不能完全反映體內(nèi)活性。
2.3.5、黏度和濁度測定：復(fù)性后的蛋白溶解度增加，變性狀態(tài)時由于疏水殘基暴露，一般水溶性很差，大多形成可見的沉淀析出。
2.3.6、免疫學(xué)方法：如ELISA、WESTERN等，特別是對結(jié)構(gòu)決定簇的抗體檢驗，比較真實的反映了蛋白質(zhì)的折疊狀態(tài)。[11]
在正常的生理條件下，組成蛋白質(zhì)的多肽鏈都能以獨特的方式進(jìn)行折疊，形成自己特有的空間結(jié)構(gòu)，以執(zhí)行某一些生命活動。當(dāng)外界環(huán)境改變時，可能造成基因突變和蛋白質(zhì)序列改變，錯誤剪接和運輸，錯誤折疊和異常聚積，形成對機(jī)體有害的反應(yīng)，引起構(gòu)象病的發(fā)生和無生物活性、不可溶的包涵體形成。目前對包涵體形成和復(fù)性過程中發(fā)生聚集的機(jī)制尚不清楚，許多已建立的高效復(fù)性方法是在反復(fù)實驗和優(yōu)化的基礎(chǔ)上建立的，且沒有普遍性，但從這許許多多的個例中發(fā)現(xiàn)了一些規(guī)律：如聚集的發(fā)生是由鏈間的疏水相互作用介導(dǎo)、聚集具有相對特異性、折疊中間體可能具有不同的作用等等，并利用這些知識建立了一些重組蛋白質(zhì)高效復(fù)興性的方法。相信隨著結(jié)構(gòu)生物學(xué)、生物信息學(xué)、蛋白質(zhì)工程學(xué)及相關(guān)新技術(shù)和新設(shè)備的發(fā)展和完善，在不久的將來，預(yù)測和設(shè)計最佳復(fù)性方案將成為可能。
參考文獻(xiàn)
1 包涵體蛋白質(zhì)的復(fù)性研究進(jìn)展 寧云山 李妍 生物技術(shù)通訊 Vol.12 No.3 Aug.2001
2 重組包涵體蛋白質(zhì)的折疊復(fù)性 馮小黎 生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展 2001;28(4)
3 Fischer B, Sumner I. Isolation, renaturation, and formation of disulfide bonds of eukaryotic proteins expressed in E.coli as inclusion bodies. Biotech Bioeng,1993,41(1)
4 王克夷 <<生命的化學(xué)>>,1999,19(5)
5 Werner M H, Clore G M, Refolding proteins by gel filtration chromatography. FEBS Lett, 1994,345(2)
6 孫彥 生物分離工程, 北京:化學(xué)工業(yè)出版社,1998
7 蛋白質(zhì)復(fù)性 史晉輝 生命的化學(xué) 2000年第6期
8 Goldberg M E, Non-detergent sulphobetaines: a new class of molecules that facilitate in vitro protein renaturation . Fold Des, 1996,1(1)
9 Misawa S et al. Biopolym, 1999,51(4)
10 Lotwin J et al. Biotechnol & Bioeng, 1999,65(4)
11 de Bernardez C E. Refolding of recombinant proteins. Curr Opin Biotechnol,1998,9(2)
12 Xie Y, Wetlaufer D B. Control of aggregation in protein refolding: the temperature-leap tactic. Protein Sci, 1996,5(3)
13 Thomas J G, Ayling A, Baneyx F. Molecular chaperones, folding catalysts, and the recovery of active recombinant proteins fom E. Coli: to fold or refold. Appl Biochem Biotechnol,1997,66(3)
