既然反義RNA在原核生物中對基因表達(dá)起著重要的調(diào)控作用，那末人工設(shè)計(jì)在天然狀態(tài)下不存在的反義RNA來調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，想必也是可能的。這已在不少實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)。
1.由于目前對靶mRNA的SD序列的上游區(qū)的結(jié)構(gòu)了解甚少，因此，在要設(shè)計(jì)Ⅱ類反義RNA用于和靶mRNASD序列上游區(qū)結(jié)合，以期達(dá)到調(diào)節(jié)該mRNA翻譯的目的是比較困難的。
2.Ⅲ類反義RNA是和mRNA的起始處結(jié)合而形成類似ρ-不依賴性的轉(zhuǎn)錄終止子而使轉(zhuǎn)錄水平上抑制靶基因的表達(dá)。因此，要設(shè)法在靶mRNA上找到一段連續(xù)的U序列，就可以設(shè)計(jì)出反義RNA，與該U序列上游的mRNA鏈互補(bǔ)，以形成ρ-不依賴性終止子。理想的作用位點(diǎn)是在靶mRNA的5'端上游的非編碼區(qū)，以免受核糖體的影響。
3.只要靶基因的核苷酸順序已經(jīng)知道，就可以人工設(shè)計(jì)出Ⅰ類反義RNA。有時還可設(shè)計(jì)同時具有Ⅰ類和Ⅲ類反義RNA功能的反義RNA。
我們還可以設(shè)計(jì)出天然存在的反義RNA的反義RNA來。這樣就可以拮抗原始反義RNA對靶mRNA的抑制作用。而達(dá)到激活或加強(qiáng)某個靶基因的表達(dá)的目的。然而并不是所有的mRNA對其相應(yīng)的Ⅰ類反義RNA都敏感。例如，有的mRNA壽命很短，只有1-2分鐘，它們和反義RNA結(jié)合的機(jī)會較少，因而就較不敏感。反之，另一些mRNA則很穩(wěn)定，壽命可達(dá)十多分種，則其對相應(yīng)的反義RNA的抑制作用就很敏感。此外，反義RNA本身的穩(wěn)定性有很大的實(shí)際意義。顯然，穩(wěn)定的反義RNA對靶mRNA的調(diào)節(jié)作用比不穩(wěn)定的反義RNA要好。
使反義RNA分子穩(wěn)定的方法如下：
[1]反義RNA3'端帶有莖環(huán)結(jié)構(gòu)或類似ρ-不依賴性終止子結(jié)構(gòu)時，可以穩(wěn)定RNA分子。
[2]Gorski等還發(fā)現(xiàn)在T4噬菌體的基因32mRNA的5'端上游的莖環(huán)結(jié)構(gòu)及其附近的序列亦可穩(wěn)定RNA分子。所以在設(shè)計(jì)反義RNA基因時，最好將產(chǎn)生3'及5'端這種二級結(jié)構(gòu)的序列克隆在反義RNA基因的兩端。Hirashima等1986年發(fā)現(xiàn)，針對靶mRNA的SD序列和AUG區(qū)域的反義RNA，要比單純對編碼區(qū)域的反義RNA更為有效。1989年Hirashima又發(fā)現(xiàn)，針對SD序列和它的上游區(qū)域(但不包括AUG)的反義RNA更為有效。在真核生物中，針對5'端非編碼區(qū)的反義RNA更有效。但也有實(shí)驗(yàn)表明針對第一內(nèi)含子的反義RNA也同樣有效。
現(xiàn)在設(shè)計(jì)反義RNA基因是時應(yīng)注意之點(diǎn)總結(jié)如下：
[1]長的反義RNA并不一定比短的反義RNA更為有效。
[2]在原核生物中針對SD序列及其附近區(qū)域的反義RNA可能更有效。
[3]在真核生物中，對應(yīng)于5'端非編碼區(qū)的反義RNA可能比針對編碼區(qū)的反義RNA更有效。
[4]盡量避免在反義RNA分子中出現(xiàn)自我互補(bǔ)的二級結(jié)構(gòu)。
[5]設(shè)計(jì)的反義RNA分子中不應(yīng)有AUG或開放讀框，否則該反義RNA亦會與核糖體結(jié)合而影響其與靶mRNA的配對結(jié)合。
[6]進(jìn)一步還可以將帶有ribozyme結(jié)構(gòu)的RNA連在反義RNA的3'端尾上，當(dāng)反義RNA與靶mRNA雜交后，即可利用其酶活性來降解靶mRNA。
此外，為了增強(qiáng)反義RNA的作用，還可以采取一些額外措施，例如:[1]由于反義RNA對靶mRNA的抑制作用有劑量依賴性，所以在構(gòu)建反義RNA基因時，要選擇強(qiáng)的、可以誘導(dǎo)的啟動子以增強(qiáng)反義RNA本身的表達(dá)。[2]構(gòu)建許多個反義RNA基因串連在一起，以得到線性重復(fù)的多拷貝基因，對提高反義RNA的表達(dá)也有利。[3]RNA酶Ⅲ可以降解RNA:RNA雜交體，所以在構(gòu)建反義RNA基因時，可將RNA酶Ⅲ的基因也同時轉(zhuǎn)化到靶細(xì)胞中并進(jìn)行表達(dá)。這樣，當(dāng)反義RNA與靶mRNA結(jié)合后，RNA酶Ⅲ即可將其降解。這顯然有利于反義RNA的抑制作用。
近年來，有關(guān)反義RNA的研究進(jìn)展迅速，已經(jīng)應(yīng)用到抗病毒感染，研究癌基因的作用機(jī)制，探索腫瘤治療的可行途徑等方面。在今后一段時間內(nèi)，有關(guān)反義RNA的研究肯定將會有更加迅速的進(jìn)展和更廣闊的應(yīng)用前景。
