一、 材料
基因組DNA(大于50kb,分別來自不同的材料)。
二、設(shè)備
電泳儀及電泳槽， 照相用塑料盆5只，玻璃或塑料板(比膠塊略大) 4塊，吸水紙若干，尼龍膜(依膠大小而定)，濾紙 ，eppendorf管(0.5ml)若干。
三、試劑：
1、限制性內(nèi)切酶(BamHⅠ, EcoRⅠ, HindⅢ, XbaⅠ)及10×酶切緩沖液。
2、5×TBE電泳緩沖液：配方見第一章。
3、變性液：0.5mol/L NaOH，1.5mol/L NaCl 。
4、中和液：1mol/LTris·Cl, pH7.5/1.5mol/L NaCl 。
5、10×SSC：配方見第九章。
6、其它試劑：0.4mol/L NaOH，0.2mol/L Tris·Cl, pH7.5/2×SSC ，ddH2O，Agarose 0.8%， 0.25mol/L HCl 。
四. 操作步驟
1. 基因組DNA的酶解
(1) 大片斷DNA的提取詳見基因組DNA提取實驗,要求提取的DNA分子量大于50kb, 沒有降解。
(2) 在50μl反應(yīng)體系中,進行酶切反應(yīng):
5μg基因組DNA
5μl 10×酶切緩沖液
20單位（U）限制酶(任意一種)
加ddH2 O, 至50μl
(3) 輕微振蕩, 離心,37℃反應(yīng)過夜。
(4) 取5μl反應(yīng)液,0.8％瓊脂糖電泳觀察酶切是否徹底，這時不應(yīng)有大于30kb的明顯亮帶出現(xiàn)。
[注意] 未酶切的DNA要防止發(fā)生降解, 酶切反應(yīng)一定要徹底。
2. Southern轉(zhuǎn)移
�。�1） 酶解的DNA經(jīng)0.8％瓊脂糖凝膠電泳(可18V過夜)后EB染色觀察。
�。�2） 將凝膠塊浸沒于0.25mol/L HCl中脫嘌呤, 10分鐘。
�。�3） 取出膠塊, 蒸餾水漂洗, 轉(zhuǎn)至變性液變性45分鐘。經(jīng)蒸餾水漂洗后轉(zhuǎn)至中和液中和30分鐘。
�。�4） 預(yù)先將尼龍膜,濾紙浸入水中,再浸入10×SSC中,將一玻璃板架于盆中鋪一層濾紙(橋)然后將膠塊反轉(zhuǎn)放置,蓋上尼龍膜,上覆二層濾紙,再加蓋吸水紙,壓上半公斤重物, 以10×SSC鹽溶液吸印,維持18-24小時。也可用電轉(zhuǎn)移或真空轉(zhuǎn)移。
�。�5） 取下尼龍膜, 0.4mol/L NaOH 30秒, 迅速轉(zhuǎn)至0.2mol/L Tris·Cl,pH7.5/2×SSC,溶液中, 5分鐘。
�。�6） 將膜夾于2層濾紙內(nèi), 80℃真空干燥2小時。
�。�7） 探針的制備和雜交見第九章分子雜交部分。
[注意] 1、 步驟（2）中脫嘌呤時間不能過長。
2、 除步驟（1）、（4）、（5）外, 其余均在搖床上進行操作。
3、步驟（4）中,當(dāng)尼龍膜覆于膠上時, 絕對防止膠與膜之間有氣泡發(fā)生, 加蓋濾時也不應(yīng)有氣泡發(fā)生。
4、有時用一種限制性內(nèi)切酶不能發(fā)現(xiàn)RFLP的差異，這時應(yīng)該試用另一種酶。
基因組DNA(大于50kb,分別來自不同的材料)。
二、設(shè)備
電泳儀及電泳槽， 照相用塑料盆5只，玻璃或塑料板(比膠塊略大) 4塊，吸水紙若干，尼龍膜(依膠大小而定)，濾紙 ，eppendorf管(0.5ml)若干。
三、試劑：
1、限制性內(nèi)切酶(BamHⅠ, EcoRⅠ, HindⅢ, XbaⅠ)及10×酶切緩沖液。
2、5×TBE電泳緩沖液：配方見第一章。
3、變性液：0.5mol/L NaOH，1.5mol/L NaCl 。
4、中和液：1mol/LTris·Cl, pH7.5/1.5mol/L NaCl 。
5、10×SSC：配方見第九章。
6、其它試劑：0.4mol/L NaOH，0.2mol/L Tris·Cl, pH7.5/2×SSC ，ddH2O，Agarose 0.8%， 0.25mol/L HCl 。
四. 操作步驟
1. 基因組DNA的酶解
(1) 大片斷DNA的提取詳見基因組DNA提取實驗,要求提取的DNA分子量大于50kb, 沒有降解。
(2) 在50μl反應(yīng)體系中,進行酶切反應(yīng):
5μg基因組DNA
5μl 10×酶切緩沖液
20單位（U）限制酶(任意一種)
加ddH2 O, 至50μl
(3) 輕微振蕩, 離心,37℃反應(yīng)過夜。
(4) 取5μl反應(yīng)液,0.8％瓊脂糖電泳觀察酶切是否徹底，這時不應(yīng)有大于30kb的明顯亮帶出現(xiàn)。
[注意] 未酶切的DNA要防止發(fā)生降解, 酶切反應(yīng)一定要徹底。
2. Southern轉(zhuǎn)移
�。�1） 酶解的DNA經(jīng)0.8％瓊脂糖凝膠電泳(可18V過夜)后EB染色觀察。
�。�2） 將凝膠塊浸沒于0.25mol/L HCl中脫嘌呤, 10分鐘。
�。�3） 取出膠塊, 蒸餾水漂洗, 轉(zhuǎn)至變性液變性45分鐘。經(jīng)蒸餾水漂洗后轉(zhuǎn)至中和液中和30分鐘。
�。�4） 預(yù)先將尼龍膜,濾紙浸入水中,再浸入10×SSC中,將一玻璃板架于盆中鋪一層濾紙(橋)然后將膠塊反轉(zhuǎn)放置,蓋上尼龍膜,上覆二層濾紙,再加蓋吸水紙,壓上半公斤重物, 以10×SSC鹽溶液吸印,維持18-24小時。也可用電轉(zhuǎn)移或真空轉(zhuǎn)移。
�。�5） 取下尼龍膜, 0.4mol/L NaOH 30秒, 迅速轉(zhuǎn)至0.2mol/L Tris·Cl,pH7.5/2×SSC,溶液中, 5分鐘。
�。�6） 將膜夾于2層濾紙內(nèi), 80℃真空干燥2小時。
�。�7） 探針的制備和雜交見第九章分子雜交部分。
[注意] 1、 步驟（2）中脫嘌呤時間不能過長。
2、 除步驟（1）、（4）、（5）外, 其余均在搖床上進行操作。
3、步驟（4）中,當(dāng)尼龍膜覆于膠上時, 絕對防止膠與膜之間有氣泡發(fā)生, 加蓋濾時也不應(yīng)有氣泡發(fā)生。
4、有時用一種限制性內(nèi)切酶不能發(fā)現(xiàn)RFLP的差異，這時應(yīng)該試用另一種酶。
