1．組織前處理
�。�1）固定：組織以10%中性福爾馬林液或Bouins液固定，常規(guī)石蠟包埋，切片厚4～6μm，粘附于涂有粘附劑的玻片上，入烤箱60～80℃6～8h，使切片更緊貼玻片。
（2）脫蠟：二甲苯10min ×2，自100%乙醇，90%，70%，50%，30%各5min。入PBS（含5mmol/l MgCl2,pH7.3～7.4）10min×2。入0.2n HCl 20min以進(jìn)一步去除蛋白。
�。�3）50℃2×SSC，含5mmol/l EDTA溶液中30min。
�。�4）蛋白酶K（1μg/ml溶于0.1mol/l PBS中，）37℃20～25min。
�。�5）0.2mol/l 甘氨酸液：室溫10min，中止蛋白酶反應(yīng)。
（6）4%多聚甲醛（PBS新鮮配制）：室溫20min。
（7）PBS/5mmol/l MgCl2漂洗10min×2。
�。�8）脫水，自低濃度到高濃度，無(wú)水乙醇各3min，空氣干燥。
2．預(yù)雜交封閉非特異性雜交位點(diǎn)，20μl/每張切片，42℃水浴半小時(shí)。
3．雜交10～20μl/每張切片，加蓋硅化蓋玻片，將切片置于95℃min，使探針及病毒DNA變性，然后迅速置于冰上1min（也有報(bào)告用乙醇使之冷卻的），然后將切片置于盛有2×SSC濕盒內(nèi)，42℃過(guò)夜（16～18h）。
4．雜交后漂洗
�。�1）2×SSC液內(nèi)振動(dòng)移除蓋片。
�。�2）2×SSc 55℃10min×2。
�。�3）0.5×SSc 55℃5min×2。
�。�4）緩沖液II（含0.5%封阻試劑，用緩沖液I溶解）37℃30min。
�。�5）緩沖液I（10mmol/l Tris –HCl, 15.0mmol/L NaCl pH7.5）15min，室溫。
�。�6）酶標(biāo)地高辛抗體（1：5000，應(yīng)用緩沖液I稀釋）37℃30min。
�。�7）緩沖液i 15min×2室溫。
�。�8）緩沖液III（100mmol/l Tris -HCl, 100mmol/L NaCl, 50mmol/L MgCl2,pH9.5）室溫2min。
5．顯色
�。�1）顯色液配制：緩沖液III：1ml中加入4.5μl四氮唑藍(lán)（NBT），3.5μl X-磷酸鹽（5-溴-4-氯-3吲哚磷酸鹽（BCIP配成））。30μl/每張切片，置暗處顯色30min到2h。定時(shí)抽查切片，鏡檢其顯色情況。
�。�2）緩沖IV（10mmol/l Tris –HCl, 1mmol/L EDTA, pH8.0）10min終止反應(yīng)，甲綠復(fù)染5min，二甲苯透明，DPX封固，鏡檢。
