�。�1）放射性碘源的選用：無(wú)載體的131I或125I均可用于碘化標(biāo)記，但應(yīng)盡量選用新鮮的、比放射強(qiáng)度高的、含還原劑量少的放射性碘源。碘源的比放射強(qiáng)度最好≥50～100mCi/ml，至少也要>30mCi/ml，否則加入碘源的容量要增加，隨著帶入碘源中含有的還原劑（為放射性碘源運(yùn)輸保存所需加入）量也增加，這將會(huì)顯著降低碘利用率及標(biāo)記蛋白比放射強(qiáng)度。放置較久和放射性碘源，一方面因衰變致比放射強(qiáng)度降低，另一方面因水的輻射化學(xué)產(chǎn)物增多（主要是131I源），都會(huì)降低標(biāo)記時(shí)的碘利用率。放射性碘源含還原劑（如Na2S2O5等）量多時(shí)，會(huì)抵消氯胺T的作用，降低碘利用率，甚至導(dǎo)致標(biāo)記完全失敗。放射性碘源要用無(wú)載體的，標(biāo)記所用全部用具和試劑必須不含碘；只要有極少量的碘的污染，非放射性碘就會(huì)稀釋放射性碘，使放射性碘利用率顯著降低。為了便于放射性防護(hù)和除污染，以及減少射線對(duì)蛋白質(zhì)分子的損傷，標(biāo)記投入的放射碘量不宜過(guò)大，一般以<5mCi為宜。
�。�2）放射性碘與多肽、蛋白質(zhì)用量的比例：這比例對(duì)標(biāo)記結(jié)果的影響很大。如上述原因，一般標(biāo)記時(shí)放射性投入量不宜過(guò)多，示蹤實(shí)驗(yàn)室中常規(guī)每次只用1～2mCi，因而放射性碘與多肽、蛋白質(zhì)用量的比值主要靠標(biāo)記時(shí)投入的多肽、蛋白質(zhì)用量來(lái)控制。當(dāng)投入的放射碘量一定時(shí)，多肽、蛋白質(zhì)用量多（即I/多肽、蛋白質(zhì)比值低），能獲得高碘利用率，但所得標(biāo)記蛋白比放射強(qiáng)度低；相反多肽、蛋白質(zhì)用量少（即I/多肽、蛋白質(zhì)比值高），則碘利用率降低，但所得標(biāo)記多肽、蛋白比放射性隨此比值變化都有較大的變動(dòng)；而當(dāng)此比值<1后，則碘利用率再下降的幅率較小，標(biāo)記多肽、蛋白比放射性也不會(huì)再增加多少。
�。�3）氯胺T與偏重亞硫酸鈉的用量及碘化反應(yīng)時(shí)間：氧化碘化標(biāo)記法中，會(huì)導(dǎo)致失活的最主要原因是氧化還原。氯胺T是氧化劑，早期用氯胺T法作碘化標(biāo)記時(shí)氯胺T用量都比較大，或碘化反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)，結(jié)果導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和活性的嚴(yán)重?fù)p傷。氯胺T用量大，或長(zhǎng)時(shí)間進(jìn)行碘化反應(yīng)，結(jié)果并不能使碘利用率和標(biāo)記多肽、蛋白質(zhì)比放射強(qiáng)度提高多少，反而使標(biāo)記多肽、蛋白活性下降。當(dāng)用不含還原劑或還原劑很少的放射性碘源時(shí)，試以各種蛋白質(zhì)（包括白蛋白、球蛋白、ACTH、胰島素等）作微量標(biāo)記，當(dāng)氯胺T用量為20μg/0.1ml反應(yīng)液、0～20。C反應(yīng)20s，碘利用率都已接近或達(dá)到最大峰，再加大氯胺T用量和延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間是沒(méi)有必要的。隨放射性碘源中還原劑增多，氯胺T用量也應(yīng)增加，以達(dá)到預(yù)期的碘利用率，但決不應(yīng)盲目加大氯胺T用量和延長(zhǎng)碘化反應(yīng)時(shí)間（通常反應(yīng)時(shí)間不要超過(guò)1min），否則會(huì)導(dǎo)致標(biāo)記多肽、蛋白質(zhì)嚴(yán)重失活，不能用于實(shí)驗(yàn)。當(dāng)然，減少氯胺T用量要在了解放射性碘源還原劑含量的基礎(chǔ)上，否則碘源中還原劑量較多，雙盲目減少氯胺T用量，就會(huì)使標(biāo)記失敗。一般用125I標(biāo)記時(shí)，氯胺T用量要適當(dāng)加大。加入氯胺T后必須迅速混勻，以防標(biāo)記不均勻。氯胺T與偏重亞硫酸鈉溶液要新配制的。
氯胺T用量減少了，Na2S2O5用量也就可以隨之減少。為保證按時(shí)終止碘化反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)時(shí)加入Na2S2O5一般都是過(guò)量的。氯胺T用量大時(shí)，加入Na2S2O5的剩余量也就會(huì)隨之增加，這就可能加重某些對(duì)還原劑敏感的蛋白質(zhì)或多肽生物活性的損傷。為此，Na2S2O5用量也不應(yīng)過(guò)多。只要藥品沒(méi)有變質(zhì)、試劑是新配的，以重量計(jì)算Na2S2O5加入量與氯胺T相同就足以保證終止碘化反應(yīng)（按反應(yīng)克分子濃度計(jì)算，Na2S2O5/氯胺T重量比約0.4），不要盲目加大用量，并應(yīng)迅速將標(biāo)記多肽、蛋白質(zhì)從反應(yīng)液中分離出來(lái)，以盡量減少多肽、蛋白質(zhì)活性的損傷。
某些蛋白質(zhì)或多肽對(duì)氯胺T較敏感，還可進(jìn)一步減少氯胺T用量、縮短碘化反應(yīng)時(shí)間、降低反應(yīng)溫度，以保護(hù)蛋白質(zhì)的活性。這對(duì)一些較容易喪失活性蛋白質(zhì)或多肽的碘標(biāo)記十分重要。
（4）碘化反應(yīng)體積：系指加入Na2S2O5終止反應(yīng)前液體的總量。碘化反應(yīng)體積愈小，局部反應(yīng)物濃度愈高，所得碘利用率和標(biāo)記多肽、蛋白比放射強(qiáng)度就愈高。所以，標(biāo)記應(yīng)采用比放射標(biāo)記效果。當(dāng)反應(yīng)液量少（<0.2～0.3ml）時(shí)，反應(yīng)體積對(duì)碘利用率和標(biāo)記多肽、蛋白質(zhì)比放射強(qiáng)度的高低影響較大；當(dāng)反應(yīng)液量大（>0.5～1.0ml）時(shí)則影響較小。微量氯胺T法放射碘標(biāo)記時(shí)，一般多控制碘化反應(yīng)體積<100μl。
�。�5）碘化反應(yīng)溫度：溫度升高，碘化反應(yīng)速度加快，碘利用率有所增加。但總的來(lái)看，反應(yīng)溫度的影響不很大，一般從0℃到20℃碘利用率相差不過(guò)百分之幾，故一般在室溫下進(jìn)行標(biāo)記操作就可能獲得重復(fù)性好的結(jié)果。有些蛋白質(zhì)或肽類極易喪失活性，則可在0℃進(jìn)行碘化反應(yīng)。
（6）碘化反應(yīng)的pH值：受氧化劑氧化生成的活性碘，對(duì)多肽鏈的酪氨酸基苯環(huán)羥基鄰位的碘化作用，最適pH是7.3～7.8之間。當(dāng)pH變化時(shí)，碘化位置也會(huì)發(fā)生變化，例如pH值較高時(shí)，組氧酸的咪唑環(huán)也可被碘化；當(dāng)pH4～5時(shí)，活性碘能迅速氧化色氨酸基生成羥基吲哚，導(dǎo)致肽鏈斷裂。這些都會(huì)影響蛋白質(zhì)或多肽的放射性碘化反應(yīng)，或引起降解或失活。因此作放射性碘化標(biāo)記時(shí)，除放射性碘源外，所有的試劑都應(yīng)用適當(dāng)?shù)木彌_液配制，保證碘化反應(yīng)在最佳pH條件下進(jìn)行。
�。�7）微量蛋白質(zhì)或多肽的吸附損失：界面的吸附損失，在使用大量蛋白質(zhì)或多肽類時(shí)是可以忽略的，但作微量法標(biāo)記時(shí)投入的蛋白質(zhì)或多肽類只在微克甚至毫克甚至毫微克水平，界面吸附導(dǎo)致的損失就不能忽略。例如制備131I—ACTH時(shí)，所用ACTH濃度低到50Pg/ml時(shí)，因表面吸附可損失10%～30%，甚至高達(dá)75%。改變pH、加入非特異性載體蛋白、或使用聚苯乙烯、聚乙烯容器時(shí)，能減少吸附，但不能完全消除。一般殘留在反應(yīng)管和滴管上的放射性為投入總放射性的2%～8%、殘留在層析柱上折占5%～10%。殘留量隨標(biāo)記蛋白比放射性強(qiáng)度而直線增減，殘留者幾乎全部都是標(biāo)記蛋白。由此可見(jiàn)，微量蛋白質(zhì)或多肽受吸附而損失的量是不容忽略的。由于微量蛋白質(zhì)、多肽會(huì)被顯著吸附而丟失，所以標(biāo)記時(shí)投入蛋白質(zhì)、多肽量過(guò)微（如<2μg）也是不適宜的，否則標(biāo)記蛋白質(zhì)、多肽的收回率會(huì)太低，并在計(jì)算上會(huì)造成較大的誤差。
（8）不同蛋白質(zhì)、多肽碘化標(biāo)記的差別：由于不同的蛋白質(zhì)和多肽分子中含有的酪氨酸數(shù)目不同，而且其空間結(jié)構(gòu)也不相同，分子中的酪按酸殘基有的容易發(fā)生碘化反應(yīng)，有的就不容易碘化，因此同樣條件下進(jìn)行碘化標(biāo)記，不同蛋白質(zhì)或多肽對(duì)碘的利用率是不相同的。不同蛋白質(zhì)經(jīng)碘化標(biāo)記后生物活性受損的情況也各不相同。例如ACTH、促性腺激素釋放激素（GRH）、促黃體激素釋放激素（LRH）等多肽，碘化標(biāo)記后容易喪失激素活性或與受體結(jié)合的活性；而AFP及人絨毛膜促性腺激素（HCG）等的碘化標(biāo)記，則較容易保存良好的免疫化學(xué)活性。
盡管不同多肽、蛋白度的碘化標(biāo)記結(jié)果有所差別，但上述討論的因素對(duì)不同多肽、蛋白質(zhì)碘化標(biāo)記的影響有共同的規(guī)律。掌握了這些因素，就容易成功地獲得合格的標(biāo)記物。
不同多肽、蛋白質(zhì)的分子量大小、理化性質(zhì)各不相同，放射碘化標(biāo)記反應(yīng)后，可根據(jù)具體情況采取不同的方法將標(biāo)記蛋白質(zhì)（或多肽）與未反應(yīng)的游離放射性碘及受損傷的標(biāo)記物分開(kāi)，常用的方法有凝膠過(guò)濾、離子交換層析、吸附層析、各種電泳法等。
