當(dāng)雙鏈DNA分子的一條鏈上產(chǎn)生切口時(shí),E.coli DNA聚合酶Ⅰ就可將核苷酸連接到切口的3'羥基末端。同時(shí)該酶具有從5'→3'的核酸外切酶活性,能從切口的5'端除去核苷酸。由于在切去核苷酸的同時(shí)又在切口的3'端補(bǔ)上核苷酸,從而使切口沿著DNA鏈移動(dòng),用放射性核苷酸代替原先無(wú)放射性的核苷酸，將放射性同位素?fù)饺氲胶铣尚骆溨小Ｗ詈线m的切口平移片段一般為50-500個(gè)核苷酸。切口平移反應(yīng)受幾種因素的影響: (a) 產(chǎn)物的比活性取決于[α-32 P]dNTP的比活性和模板中核苷酸被置換的程度。(b) DNA酶Ⅰ的用量和E.coli DNA聚合酶的質(zhì)量會(huì)影響產(chǎn)物片段的大小。(c) DNA模板中的抑制物如瓊脂糖會(huì)抑制酶的活性, 故應(yīng)使用仔細(xì)純化后的DNA。
材料： 待標(biāo)記的DNA。
設(shè)備：高速臺(tái)式離心機(jī)，恒溫水浴鍋等。
試劑：
(1)10×切口平移緩沖液:0.5mol/L Tris·Cl (pH7.2); 0.1mol/L MgSO4 ; 10mmol/L DTT; 100μg/ml BSA。
(2)未標(biāo)記的dNTP原液:除同位素標(biāo)記的脫氧三磷酸核苷酸外,其余3種分別溶解于50mmol/L Tris·Cl (pH7.5)溶液中,濃度為0.3mmol/L。
(3)[α-32 P] dCTP或[α-32 P]dATP:400 Ci/mmol, 10μCi/μl。
(4) E.coli DNA聚合酶Ⅰ(4單位/μ l):溶于50μ g/ml BSA, 1mmol/L DTT, 50%甘油，50mmol/L Tris·Cl(pH7.5)中。
(5)DNA酶Ⅰ:1mg/ml。
(6)EDTA :200mmol/L (pH8.0)。
(7)10mol/L NH4Ac。
操作步驟:
(1) 按下列配比混合:
未標(biāo)記的dNTP 10μl
10×切口平移緩沖液 5μl
待標(biāo)記的DNA 1μg
[α-32 P]dCTP或dATP(70μCi) 7μl
E.coli DNA聚合酶 4單位
DAN酶 I 1μl
加水至終體積 50μl
(2) 置于15℃水浴60分鐘。
(3) 加入5μl EDTA終止反應(yīng)。
(4) 反應(yīng)液中加入醋酸銨,使終濃度為0.5mol/L, 加入兩倍體積預(yù)冷無(wú)水乙醇沉淀回收DNA探針。
材料： 待標(biāo)記的DNA。
設(shè)備：高速臺(tái)式離心機(jī)，恒溫水浴鍋等。
試劑：
(1)10×切口平移緩沖液:0.5mol/L Tris·Cl (pH7.2); 0.1mol/L MgSO4 ; 10mmol/L DTT; 100μg/ml BSA。
(2)未標(biāo)記的dNTP原液:除同位素標(biāo)記的脫氧三磷酸核苷酸外,其余3種分別溶解于50mmol/L Tris·Cl (pH7.5)溶液中,濃度為0.3mmol/L。
(3)[α-32 P] dCTP或[α-32 P]dATP:400 Ci/mmol, 10μCi/μl。
(4) E.coli DNA聚合酶Ⅰ(4單位/μ l):溶于50μ g/ml BSA, 1mmol/L DTT, 50%甘油，50mmol/L Tris·Cl(pH7.5)中。
(5)DNA酶Ⅰ:1mg/ml。
(6)EDTA :200mmol/L (pH8.0)。
(7)10mol/L NH4Ac。
操作步驟:
(1) 按下列配比混合:
未標(biāo)記的dNTP 10μl
10×切口平移緩沖液 5μl
待標(biāo)記的DNA 1μg
[α-32 P]dCTP或dATP(70μCi) 7μl
E.coli DNA聚合酶 4單位
DAN酶 I 1μl
加水至終體積 50μl
(2) 置于15℃水浴60分鐘。
(3) 加入5μl EDTA終止反應(yīng)。
(4) 反應(yīng)液中加入醋酸銨,使終濃度為0.5mol/L, 加入兩倍體積預(yù)冷無(wú)水乙醇沉淀回收DNA探針。
