亞克隆的基本過程包括：(1)目的DNA片段和載體的制備；(2)目的DNA片段和載體的連接；(3)連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化；(4)重組子篩選。
一、試劑準(zhǔn)備
1．LB液體培養(yǎng)基：胰化蛋白胨（細(xì)菌培養(yǎng)用）10g，酵母提取物（細(xì)菌培養(yǎng)用） 5g，NaCl 10g，加ddH2O 至1000ml，完全溶解，分裝小瓶，15lbf/in2高壓滅菌20min。
2．1.5%瓊脂LB固體培養(yǎng)基: 稱取1.5g瓊脂粉放入300ml錐形瓶,加100ml LB，15 lbf/in2 高壓滅菌20min，稍冷卻，制備平皿。
3．IPTG、X-Gal
4．0.1M MgCl2 ：15 lbf/in2高壓滅菌20min，0℃冰浴備用。
5．0.1M CaCl2（以20%甘油水溶液配制）：15 lbf/in2高壓滅菌20min，0℃冰浴備用。
6．限制性核酸內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶。
二、目的DNA片段和載體的制備
選擇適宜的限制性核酸內(nèi)切酶，消化已知目的DNA和載體，獲得線性DNA，用于重組。根據(jù)目的DNA和載體的具體情況，選擇一種或者兩種適當(dāng)?shù)南拗泼盖懈睿謩e產(chǎn)生對稱性粘性末端（用一種限制性內(nèi)切酶進(jìn)行消化而產(chǎn)生帶有互補(bǔ)突出端）、不對稱粘性末端（用兩種不同的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行消化而產(chǎn)生帶有非互補(bǔ)突出端）、平端。在亞克隆時(shí)，首選不對稱相容末端連接，次選對稱性粘性相容性末端連接，由于平末端連接效率較低，通常很少采用。但有時(shí)目的片段的末端與載體不匹配 ，一般先將不匹配末端補(bǔ)平，然后再以平末端連接。
三、利用T4 DNA連接酶進(jìn)行目的DNA片段和載體的體外連接
（一）連接要求和結(jié)果
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外源DNA片段末端性質(zhì)
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連接要求
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連接結(jié)果
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不對稱粘性末端
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兩種限制酶消化后，需純化載體以提高連接效率
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載體與外源DNA連接處的限制酶切位點(diǎn)�？杀Ａ簦环侵亟M克隆的背景較低；外源DNA可以定向插入到載體中。
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對稱性粘性末端
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線形載體DNA常需磷酸酶脫磷處理
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載體與外源DNA連接處的限制酶切位點(diǎn)�？杀Ａ�；重組質(zhì)粒會(huì)帶有外源DNA的串聯(lián)拷貝；外源DNA會(huì)以兩個(gè)方向插入到載體中。
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平端
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要求高濃度的DNA和連接酶
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載體與外源DNA連接處的限制酶切位點(diǎn)消失；重組質(zhì)粒會(huì)帶有外源DNA的串聯(lián)拷貝；非重組克隆的背景較高 。
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帶有相同末端(平端或粘端)的外源DNA片段必須克隆到具有匹配末端的線性質(zhì)粒載體中,但是在連接反應(yīng)時(shí),外源DNA和質(zhì)粒都可能發(fā)生環(huán)化,也有可能形成串聯(lián)寡聚物。因此，必須仔細(xì)調(diào)整連接反應(yīng)中兩個(gè)DNA 的濃度，以便使“正確”連接產(chǎn)物的數(shù)量達(dá)到最佳水平，此外還常常使用堿性磷酸酶去除5’磷酸基團(tuán)以抑制載體DNA的自身環(huán)化。利用T4 DNA連接酶進(jìn)行目的DNA片段和載體的體外連接反應(yīng)，也就是在雙鏈DNA 5’磷酸和相鄰的3’羥基之間形成新的共價(jià)鍵。如載體的兩條鏈都帶有5’磷酸（未脫磷），可形成4個(gè)新的磷酸二酯鍵；如載體DNA已脫磷，則只能形成2個(gè)新的磷酸二酯鍵，此時(shí)產(chǎn)生的重組DNA帶有兩個(gè)單鏈缺口，在導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞后可被修復(fù)。
（二）T4 DNA連接酶對目的DNA片段和載體連接的一般方案
1．連接反應(yīng)一般在滅菌的0.5ml離心管中進(jìn)行。
2．10μl體積反應(yīng)體系中：取載體50-100ng，加入一定比例的外源DNA 分子（一般線性載體DNA分子與外源DNA分子摩爾數(shù)為1∶1-1∶5），補(bǔ)足ddH2O 至8μl。
3．輕輕混勻，稍加離心，56℃水浴5min后，迅速轉(zhuǎn)入冰浴。
4．加入含ATP的10×Buffer 1μl，T4 DNA連接酶合適單位， 用ddH2O 補(bǔ)至10μl，稍加離心，在適當(dāng)溫度（一般14-16℃水浴）連接8-14hr。
四、連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
1.感受態(tài)細(xì)胞的制備
⑴ 保存于-70℃的DH5α（或其他菌種）用接種環(huán)劃菌于1.5%瓊脂平板上，37℃恒溫倒置培養(yǎng)至單菌落出現(xiàn)（約14-16 hr）。
⑵ 挑取單菌落，接種于2.0ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫，250g振蕩培養(yǎng)過夜（約12hr）。
⑶ 取0.5ml 過夜培養(yǎng)液，接種于100ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)2-2.5hr，至OD600為0.4-0.5時(shí)，放置于4℃冰箱冷卻1-2hr。
（注：以下操作均應(yīng)在冰浴中進(jìn)行。）
⑷ 將培養(yǎng)液分入兩個(gè)50ml離心管中，4℃離心，4000g×10min，棄去上清，用冰浴的0.1M MgCl2 25ml懸浮30min。
⑸ 4℃離心,4000g×10min，棄去上清，加入冰浴的0.1M CaCl2-甘油溶液1ml懸浮。
⑹ 以100μl/管分裝入1.5ml離心管中，-70℃凍存?zhèn)溆谩?br />注：此法制備感受態(tài)細(xì)胞，可使每微克超螺旋質(zhì)粒DNA產(chǎn)生5×106-2×107個(gè)菌落，這樣的轉(zhuǎn)化效率足以滿足所有在質(zhì)粒中進(jìn)行的常規(guī)克隆的需要，制備的感受態(tài)細(xì)胞可貯存于-70℃，但保存時(shí)間過長會(huì)使轉(zhuǎn)化效率在一定程度上受到影響，一般三個(gè)月以內(nèi)轉(zhuǎn)化效率無多大改變。
2. 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
⑴ 取100μl貯存于-70℃鈣化菌，冰浴化開；
⑵ 加入適量連接產(chǎn)物（一般不超過10μl，輕輕混勻，冰浴20min；
⑶ 于42℃熱休克90s，迅速轉(zhuǎn)移至冰浴中，繼續(xù)冰浴2-3min；
⑷ 加入LB液體培養(yǎng)基200μl，于37℃緩搖孵育45min；
⑸ 將培養(yǎng)物適量涂于1.5%瓊脂LB平板（根據(jù)質(zhì)粒性質(zhì)添加抗生素或/和X-Gal/IPTG），待膠表面沒有液體流動(dòng)時(shí)，37℃溫箱倒置培養(yǎng)12-16hr。
五、重組子的篩選
根據(jù)載體的遺傳特征篩選重組子，如α-互補(bǔ)、抗生素基因等。現(xiàn)在使用的許多載體都帶有一個(gè)大腸桿菌的DNA的短區(qū)段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的調(diào)控序列和前146個(gè)氨基酸的編碼信息。在這個(gè)編碼區(qū)中插入了一個(gè)多克隆位點(diǎn)（MCS），它并不破壞讀框，但可使少數(shù)幾個(gè)氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影響功能，這種載體適用于可編碼β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主細(xì)胞。因此，宿主和質(zhì)粒編碼的片段雖都沒有酶活性，但它們同時(shí)存在時(shí)，可形成具有酶學(xué)活性的蛋白質(zhì)。這樣，lacZ基因在缺少近操縱基因區(qū)段的宿主細(xì)胞與帶有完整近操縱基因區(qū)段的質(zhì)粒之間實(shí)現(xiàn)了互補(bǔ)，稱為α-互補(bǔ)。由α-互補(bǔ)而產(chǎn)生的LacZ 細(xì)菌在誘導(dǎo)劑IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在時(shí)產(chǎn)生藍(lán)色菌落，因而易于識(shí)別。然而，當(dāng)外源DNA插入到質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)后，幾乎不可避免地導(dǎo)致無α-互補(bǔ)能力的氨基端片段，使得帶有重組質(zhì)粒的細(xì)菌形成白色菌落。這種重組子的篩選，又稱為藍(lán)白斑篩選。如用藍(lán)白斑篩選則經(jīng)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的鈣化菌平板37℃溫箱倒置培養(yǎng)12-16hr后，有重組質(zhì)粒的細(xì)菌形成白色菌落。
六、注意事項(xiàng)
1. 目的DNA片段制備、回收、純化時(shí)，應(yīng)避免外來DNA污染。
2. 不同廠家生產(chǎn)的T4 DNA連接酶反應(yīng)條件稍有不同，但其產(chǎn)品說明書上均有最適反應(yīng)條件，包括對不同末端性質(zhì)DNA分子連接的T4 DNA連接酶的用量、作用溫度、時(shí)間等。同時(shí)提供有連接酶緩沖液（10×、5×、2×），其中多已含有要求濃度的ATP，應(yīng)避免高溫放置和反復(fù)凍融使其分解。
2. 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化：細(xì)菌細(xì)胞經(jīng)特殊試劑處理后在適當(dāng)?shù)臈l件下具有接收外源DNA的能力，因此可將上述連接產(chǎn)物通過熱刺激或電脈沖轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，當(dāng)細(xì)菌大量增殖的同時(shí)，導(dǎo)入的重組DNA也得到增殖。
3. 制備感受態(tài)細(xì)胞所用離心管、培養(yǎng)瓶最好經(jīng)酸堿處理或使用新的，15 lbf/in2高壓滅菌20min。
5. 白色菌落中重組質(zhì)粒內(nèi)插入片段是否是目的片段需通過鑒定。
