DNA探針

　　DNA探針是最常用的核酸探針，指長(zhǎng)度在幾百堿基對(duì)以上的雙鏈DNA或單鏈DNA探針�，F(xiàn)已獲得DNA探針數(shù)量很多，有細(xì)菌、病毒、原蟲、真菌、動(dòng)物和人類細(xì)胞DNA探針。這類探針多為某一基因的全部或部分序列，或某一非編碼序列。這些DNA片段須是特異的，如細(xì)菌的毒力因子基因探針和人類Alu探針。這些DNA探針的獲得有賴于分子克隆技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用。以細(xì)菌為例，目前分子雜交技術(shù)用于細(xì)菌的分類和菌種鑒定比之G C百分比值要準(zhǔn)確的多，是細(xì)菌分類學(xué)的一個(gè)發(fā)展方向。加之分子雜交技術(shù)的高敏感性，分子雜交在臨床微生物診斷上具有廣闊的前景。細(xì)菌的基因組大小約5×106bp，約含3000個(gè)基因。各種細(xì)菌之間絕大部分DNA是相同的，要獲得某細(xì)菌特異的核酸探針，通常要采取建立細(xì)菌基因組DNA文庫(kù)的辦法，即將細(xì)菌DNA切成小片段后分別克隆得到包含基因組的全信息的克隆庫(kù)。然后用多種其它菌種的DNA作探針來(lái)篩選，產(chǎn)生雜交信號(hào)的克隆被剔除，最后剩下的不與任何其它細(xì)菌雜交的克隆則可能含有該細(xì)菌特異性DNA片段。將此重組質(zhì)粒標(biāo)記后作探針進(jìn)一步鑒定，亦可經(jīng)DNA序列分析鑒定其基因來(lái)源和功能。因此要得到一種特異性DNA探針，常常是比較繁瑣的。探針DNA克隆的篩選也可采用血清學(xué)方法，所不同的是所建DNA文庫(kù)為可表達(dá)性，克隆菌落或噬斑經(jīng)裂解后釋放出表達(dá)抗原，然后用來(lái)源細(xì)菌的多克隆抗血清篩選陽(yáng)性克隆，所得到多個(gè)陽(yáng)性克隆再經(jīng)其它細(xì)菌的抗血清篩選，最后只與本細(xì)菌抗血清反應(yīng)的表達(dá)克隆即含有此細(xì)菌的特異性基因片段，它所編碼的蛋白是該菌種所特有的。用這種表達(dá)文庫(kù)篩選得到的顯然只是特定基因探針。

　　對(duì)于基因探針的克隆尚有更快捷的途徑。這也是許多重要蛋白質(zhì)的編碼基因的克隆方法。該方法的第一步是分離純化蛋白質(zhì)，然后測(cè)定該蛋白的氨基或羥基末端的部分氨基酸序列，然后根據(jù)這一序列合成一套寡核苷酸探針。用此探針在DNA文庫(kù)中篩選，陽(yáng)性克隆即是目標(biāo)蛋白的編碼基因。值得一提的是真核細(xì)胞和原核細(xì)胞DNA組織有所不同。真核基因中含有非編碼的內(nèi)含子序列，而原核則沒(méi)有。因此，真核基因組DNA探針用于檢測(cè)基因表達(dá)時(shí)雜交效率要明顯低于cDNA探針。

　　DNA探針（包括cDNA探針）的主要優(yōu)點(diǎn)有下面三點(diǎn)：①這類探針多克隆在質(zhì)粒載體中，可以無(wú)限繁殖，取之不盡，制備方法簡(jiǎn)便。②DNA探針不易降解（相對(duì)RNA而言），一般能有效抑制DNA酶活性。③DNA探針的標(biāo)記方法較成熟，有多種方法可供選擇，如缺口平移，隨機(jī)引物法，PCR標(biāo)記法等，能用于同位素和非同位素標(biāo)記。