SDL方法（Gene splicing by directed liga- tion），即直接拼接法，在SOE法基礎(chǔ)上又有新的突破：
（1）限制性內(nèi)切酶，EcoRI核酸內(nèi)切酶（或其它Ⅱs類限制性內(nèi)切酶）能專一性識(shí)別 6bp的非回文序列，并能單向特異性地切斷EcoRI識(shí)別的6bp以外的1—5個(gè)核苷酸，產(chǎn) 生一個(gè)以突出的4個(gè)核苷酸為結(jié)尾的5'末端。因而該伸頭末端與酶切位點(diǎn)序列無關(guān)， 而是由切點(diǎn)附近的序列決定的。
（2）擴(kuò)增時(shí)實(shí)際運(yùn)用的引物的構(gòu)建。以exon5的實(shí)用引物為例：5'鏈引物包括常規(guī)5' 鏈引物序列和BamHI識(shí)別位點(diǎn)及起密碼序列；3'鏈引物包括常規(guī)3'鏈引物和AC及EcoRI 識(shí)別位點(diǎn)。
�。�3）唯一性末端的形成。經(jīng)擴(kuò)增和限制性內(nèi)切酶處理后可得供拼接的exon5，它的右 側(cè)突出末端TCAC中，TC為原始exon5的一部分，AC為原始exon6的一部分，且TCAC與 exon6的AGTG互補(bǔ)配對(duì)，其余類推。因?yàn)檫@種結(jié)尾相同的幾率為1/259，故可被視作 “唯一性末端”。
�。�4）把經(jīng)擴(kuò)增的exon5、exon6和exon7混合，依據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，它們就能按順 序依次拼接。
（1）限制性內(nèi)切酶，EcoRI核酸內(nèi)切酶（或其它Ⅱs類限制性內(nèi)切酶）能專一性識(shí)別 6bp的非回文序列，并能單向特異性地切斷EcoRI識(shí)別的6bp以外的1—5個(gè)核苷酸，產(chǎn) 生一個(gè)以突出的4個(gè)核苷酸為結(jié)尾的5'末端。因而該伸頭末端與酶切位點(diǎn)序列無關(guān)， 而是由切點(diǎn)附近的序列決定的。
（2）擴(kuò)增時(shí)實(shí)際運(yùn)用的引物的構(gòu)建。以exon5的實(shí)用引物為例：5'鏈引物包括常規(guī)5' 鏈引物序列和BamHI識(shí)別位點(diǎn)及起密碼序列；3'鏈引物包括常規(guī)3'鏈引物和AC及EcoRI 識(shí)別位點(diǎn)。
�。�3）唯一性末端的形成。經(jīng)擴(kuò)增和限制性內(nèi)切酶處理后可得供拼接的exon5，它的右 側(cè)突出末端TCAC中，TC為原始exon5的一部分，AC為原始exon6的一部分，且TCAC與 exon6的AGTG互補(bǔ)配對(duì)，其余類推。因?yàn)檫@種結(jié)尾相同的幾率為1/259，故可被視作 “唯一性末端”。
�。�4）把經(jīng)擴(kuò)增的exon5、exon6和exon7混合，依據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，它們就能按順 序依次拼接。
