1 基因芯片技術(shù)分離目的基因
生物芯片是高密度固定在固相支持介質(zhì)上的生物信息分子的微列陣。列陣中每個(gè)分子的序列及位置都是已知的，并按預(yù)先設(shè)定好的順序點(diǎn)陣�；蛐酒巧镄酒囊环N，其上固定的是核算類物質(zhì)，主要用于DNA、RNA分析。分為DNA芯片和微點(diǎn)陣兩種。
分離目的基因是是指從基因組中發(fā)現(xiàn)或找出某個(gè)目的（標(biāo)）基因。目前是通過(guò)①比較不同物種之間，或同一物種不同個(gè)體之間；或同一個(gè)體在不同生長(zhǎng)發(fā)育是期或不同環(huán)境條件下基因差異表達(dá)（基因表達(dá)平行分析）來(lái)實(shí)現(xiàn)的。采用基因芯片技術(shù)進(jìn)行基因差異表達(dá)研究可以通過(guò)雜交直接檢測(cè)到細(xì)胞中mRNA的種類及豐度，與傳統(tǒng)的差異顯示相比具有樣品用量小，自動(dòng)化程度高，被檢測(cè)目標(biāo)DNA密度大及并行種類多等優(yōu)點(diǎn)。②利用同源探針從cDNA或EST微列陣中篩選分離目的基因。目前有DNA芯片、cDNA芯片兩種。其基本步驟包括：基因芯片的制備、靶樣品制備、雜交與檢測(cè)、目的基因得分離并獲得全長(zhǎng)。
2 基因文庫(kù)技術(shù)分離目的基因
基因文庫(kù)指某一生物類型全部基因的集合。這種集合是以重組體的形式出現(xiàn)。某生物DNA片段群體與載體分子重組，重組后轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，轉(zhuǎn)化細(xì)胞在選擇培養(yǎng)基上生長(zhǎng)出的單個(gè)菌落（或噬菌斑，或成活細(xì)胞）即為一個(gè)DNA片段的克隆。全部DNA片段克隆的集合體即為該生物的基因文庫(kù)。其類型很多，如可分為基因組文庫(kù)與cDNA文庫(kù)、克隆文庫(kù)與表達(dá)文庫(kù)，按載體分有智力文庫(kù)、噬菌體文庫(kù)、黏粒載體文庫(kù)、人工染色體文庫(kù)等�；蛭膸�(kù)構(gòu)建后，從文庫(kù)中篩選基因的方法主要有以下幾種：核算雜交法、免疫學(xué)檢測(cè)法、DNA同胞選擇法、PCR篩選法等�；蛭膸�(kù)的構(gòu)建是目前基因工程的核心工作，也是分離目的進(jìn)的常用方法之一。
3 功能蛋白組分離目的基因
蛋白組是指細(xì)胞內(nèi)全部蛋白的存在及活動(dòng)方式，即基因組表達(dá)產(chǎn)生的總蛋白質(zhì)的統(tǒng)稱。功能蛋白質(zhì)組指那些可能涉及到特定功能機(jī)理的蛋白質(zhì)群體。主要研究方法為蛋白質(zhì)雙向電泳。通過(guò)高效液相色譜、質(zhì)普對(duì)蛋白質(zhì)序列進(jìn)行分析，在借用分子生物學(xué)的手段則可以進(jìn)行目的基因的分離。如：應(yīng)用PCR進(jìn)行分離目的基因：通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)的序列分析，可以通過(guò)密碼子的簡(jiǎn)并性設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，可利用RT-PCR得到目的基因的全長(zhǎng)；應(yīng)用核算雜交篩選法分離目的基因：即利用簡(jiǎn)并寡核苷酸探針篩選cDNA或基因組文庫(kù)；免疫雪篩選法分離目的基因：是通過(guò)蛋白的特異抗體與目的蛋白的專一結(jié)合，從表達(dá)文庫(kù)中分離目的基因的蛋白基因。
4 PCR技術(shù)在基因克隆中的應(yīng)用
PCR技術(shù)已經(jīng)滲透到生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域，在分子克隆和獲得cDNA全長(zhǎng)方面起著重要的作用。利用PCR技術(shù)對(duì)特定條件下基因的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)即通過(guò)mRNA差別顯示（DDRT-PCR）可鑒定和分離出所需的目的基因；通過(guò)RT-PCR克隆到目的基因的cDNA區(qū)域進(jìn)行cDNA文庫(kù)的構(gòu)建，通過(guò)錨定PCR或反向PCR可快速克隆到cDNA末端未知序列、功能基因調(diào)控區(qū)等�，F(xiàn)在可用于基因分離和克隆的PCR方法主要有：RT-PCR，DDRT-PCR，用于cDNA末端快速克隆的RACE（第3小節(jié)），用于DNA序列克隆的Panhankle-PCR、Cassette-PCR以及減法cDNA文庫(kù)的PCR法構(gòu)建等。Panhankle-PCR、Cassette-PCR為基因組已知DNA相臨未知序列的克隆奠定了良好的基礎(chǔ)。
5 mRNA差別顯示技術(shù)分離差別表達(dá)基因
mRNA差異顯示技術(shù)是對(duì)組織特異性表達(dá)基因進(jìn)行分離的一種快速行之有效的方法之一。它是將mRNA反轉(zhuǎn)錄與PCR技術(shù)結(jié)合發(fā)展起來(lái)的一種RNA指紋圖譜技術(shù)。它利用5’錨定引物oligo（dT）12MN和3’端隨機(jī)引物對(duì)總mRNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以期得到差異表達(dá)的條帶。并對(duì)其差異顯示的條帶進(jìn)行回收、克隆。
6 插入突變分離克隆目的基因
獲得突變體進(jìn)行未知基因的克隆是常用的方法之一。這里舉T-DNA標(biāo)簽法和轉(zhuǎn)座子誘變分離克隆目的基因的例子。T-DNA標(biāo)簽法是將T-DNA在任何感興趣的基因處產(chǎn)生插入性突變，獲得分析該基因功能的對(duì)照突變體。它將T-DNA左右邊界之間攜帶的外源報(bào)告基因片段作為一個(gè)選擇性的遺傳標(biāo)記，因?yàn)椴迦氲男蛄惺且阎�，因而�?duì)獲得的轉(zhuǎn)基因重組突變體就可以通過(guò)各種克隆和PCR策略加以研究。倘若將35S強(qiáng)啟動(dòng)子在T-DNA整合到宿主基因組后，整合到內(nèi)原基因的上游，則可以產(chǎn)生異常增加或表達(dá)的時(shí)空特異性改變而破壞基因的表達(dá)的效果。有獲得性突變和功能喪失性突變等。轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法是將一株攜帶有功能性轉(zhuǎn)座系統(tǒng)的植物與遺傳上有差異的同種植物雜交，因轉(zhuǎn)座因子插入到某一特定的基因序列而破壞了該基因編碼的蛋白，進(jìn)而導(dǎo)致可見(jiàn)的表性的破壞或改變，這樣就可以在產(chǎn)生后代中篩選出新型的突變體。
7 圖位克隆目的基因
圖位克隆的原理是根據(jù)功能基因在基因組中都有相對(duì)較穩(wěn)定的基因座，在利用分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)目的基因進(jìn)行精細(xì)定位的基礎(chǔ)上，用與目的基因機(jī)密連鎖得分子標(biāo)記篩選DNA文庫(kù)，從而構(gòu)建目的基因區(qū)域的物理圖譜，在利用此物理圖譜通過(guò)染色體步移逐步逼近目的基因或通過(guò)染色體登錄的方法最終找到包含該目的基因的克隆，并通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)證實(shí)目的基因的功能。
8 酵母雙雜交系統(tǒng)分離克隆基因
酵母雙雜交系統(tǒng)體系可以發(fā)現(xiàn)蛋白相互作用的蛋白的編碼基因。這種方法的用途有：驗(yàn)證已知基因間的相互作用；可以快速發(fā)現(xiàn)編碼蛋白與蛋白間相互作用的特定區(qū)域；通過(guò)掃描文庫(kù)與活化區(qū)域的作用可以發(fā)現(xiàn)相互所用的蛋白，只需一個(gè)質(zhì)粒就可以直接得到編碼蛋白的基因，無(wú)需制備抗體和純化蛋白。操作相對(duì)簡(jiǎn)便、快速，不許經(jīng)過(guò)蛋白純化即可獲得編碼基因。
9 生物信息學(xué)在分離克隆基因中的應(yīng)用
生物信息學(xué)是在生命科學(xué)的研究中，一計(jì)算機(jī)為工具對(duì)生物信息進(jìn)行儲(chǔ)存、檢索、和分析的科學(xué)�；蚪M信息學(xué)的首要任務(wù)之一就是發(fā)現(xiàn)新的基因核心的功能，時(shí)發(fā)現(xiàn)新基因的重要手段。下舉幾例：
利用EST數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)新基因（電腦克�。簩ふ业脚c克隆有關(guān)的EST后，用電子cDNA文庫(kù)進(jìn)行篩選；通過(guò)生物信息學(xué)軟件進(jìn)行分析和查詢，最終獲得一個(gè)基因的全長(zhǎng)cDNA。
通過(guò)保守區(qū)發(fā)現(xiàn)和可隆基因：即利用同源蛋白質(zhì)的保守序列或同源基因火爆后區(qū)段進(jìn)行電子篩選，在進(jìn)一步拼接、延伸從而獲得全長(zhǎng)的cDNA。
從大規(guī)模cDNA文庫(kù)測(cè)序的序列中確定新基因：首先確定獲得的cDNA是否為基因全長(zhǎng)cDNA，確定是否有典型的ORF及3’端及5’端。而后可以通過(guò)網(wǎng)上搜索確定是否為新的基因，同源比對(duì)在判斷是否為新基因，若通過(guò)檢驗(yàn)則為新的基因。
10 基因分離克隆的新技術(shù)
除上述幾種基本的方法外，隨著生物技術(shù)的發(fā)展和傳統(tǒng)技術(shù)的改良，基因可隆的方法又有許多新的技術(shù)出現(xiàn)。如基因表達(dá)序類標(biāo)記分析（SAGE）；由DDRT-PCR演變而來(lái)的代表性差異分析（RDA），包括基因組DNA（gDNA）的RDA和cDNA的RDA；抑制型差減雜交（SSH）——基于反轉(zhuǎn)錄的雙接頭扣除的差異分析；轉(zhuǎn)錄活動(dòng)的DNA差減雜交技術(shù)（TADSH）、利用限制性片段多態(tài)性的cDNA-AFLP等等。這些技術(shù)作為基因分離可隆的方法，較以前的技術(shù)都具有一定的優(yōu)點(diǎn)，又有各自的不盡相同的用途。
