引物設(shè)計有3 條基本原則：首先引物與模板的序列要緊密互補，其次引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)，再次引物不能在模板的非目的位點引發(fā)DNA 聚合反應(yīng)(即錯配)。引物設(shè)計應(yīng)注意如下要點：
1 引物的長度一般為15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不應(yīng)大于38，因為過長會導致其延伸溫度大于74℃，不適于Taq DNA 聚合酶進行反應(yīng)。
2 引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當沒有相似性較高，尤其是3’端相似性較高的序列，否則容易導致錯配。引物3’端出現(xiàn)3 個以上的連續(xù)堿基，如GGG 或CCC，也會使錯誤引發(fā)機率增加[2]。
3 引物3’端的末位堿基對Taq 酶的DNA 合成效率有較大的影響。不同的末位堿基在錯配位置導致不同的擴增效率，末位堿基為A 的錯配效率明顯高于其他3 個堿基，因此應(yīng)當避免在引物的3’端使用堿基A[3][4]。另外，引物二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導致PCR 反應(yīng)失敗。5’端序列對PCR 影響不太大，因此常用來引進修飾位點或標記物[2]。
4 引物序列的GC 含量一般為40-60%，過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的GC含量不能相差太大。
5 引物所對應(yīng)模板位置序列的Tm 值在72℃左右可使復性條件最佳。Tm 值的計算有多種方法，如按公式Tm＝4(G C)＋2(A T)，在Oligo 軟件中使用的是最鄰近法(the nearest neighbor method)。
6 ∆G 值是指DNA 雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對的相對穩(wěn)定性。應(yīng)當選用3’端∆G 值較低（絕對值不超過9），而5’端和中間∆G 值相對較高的引物。引物的3’端的∆G 值過高，容易在錯配位點形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA 聚合反應(yīng)[6]。
7 引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值過高（超過4.5kcal/mol）易導致產(chǎn)生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使PCR 反應(yīng)不能正常進行[8]。
8 對引物的修飾一般是在5’端增加酶切位點，應(yīng)根據(jù)下一步實驗中要插入PCR 產(chǎn)物的載體的相應(yīng)序列而確定。
