完整RNA的提取和純化,是進(jìn)行RNA方面的研究工作,如Nothern雜交、mRNA分離、RT-PCR、定量PCR、cDNA合成及體外翻譯等的前提。所有ＲＮＡ的提取過程中都有五個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)，即１）：樣品細(xì)胞或組織的有效破碎；２），有效地使核蛋白復(fù)合體變性；３），對(duì)內(nèi)源ＲＮＡ酶的有效抑制；４）有效地將ＲＮＡ從ＤＮＡ和蛋白混合物中分離；5），對(duì)于多糖含量高的樣品還牽涉到多糖雜質(zhì)的有效除去。但其中最關(guān)鍵的是抑制ＲＮＡ酶活性。RNA的提取目前階段主要可采用兩種途徑，1),提取總核酸，再用氯化鋰將RNA沉淀出來(lái)；2),直接在酸性條件下抽提，酸性下DNA與蛋白質(zhì)進(jìn)入有機(jī)相而RNA留在水相。第一種提取方法將導(dǎo)致小分子量RNA的丟失，目前該方法的使用頻率已很低。
方法一:總RNA的試劑盒快速提取
一些公司推出的總RNA提取試劑盒,可以用來(lái)制備咧柿康目捎糜誚?獾腞NA。該總RNA純化系統(tǒng)采用兩種著名的RNA酶抑制劑,異硫氰酸弧(GTC)和β-巰基乙醇,加上整個(gè)操作都在冰浴下進(jìn)行,這樣就能顯著降低RNA的降解速率。GTC和N-十二烷基肌氨酸鈉的聯(lián)合使用,將促使核蛋白復(fù)合體的解離,使RNA與蛋白質(zhì)分離,并將RNA釋放到溶液中。而進(jìn)一步從復(fù)合體中純化RNA,則根據(jù)Chomc zynski和Sacchi的一步快速抽提法進(jìn)行,采用酸性酚-氯仿混合液抽提。低pH值的酚將使RNA進(jìn)入水相,這樣使其與仍留在有機(jī)相中的蛋白質(zhì)和DNA分離。水相中的RNA可用異丙醇沉淀濃縮。進(jìn)一步將上述RNA沉淀復(fù)溶于GTC溶液中，接著用異丙醇進(jìn)行二次沉淀，隨后用乙醇洗滌沉淀，即可去除所有殘留的蛋白質(zhì)和無(wú)機(jī)鹽，而RNA中如含無(wú)機(jī)鹽,則有可能對(duì)以后操作中的一些酶促反應(yīng)產(chǎn)生抑制。
一：儀器
恒溫水浴,冷凍高速離心機(jī),紫外分光光度計(jì),取液器,電泳儀,電泳槽
二：試劑
RNA提取試劑盒,0.05%焦碳酸二乙酯(DEPC),75%乙醇
操作步驟
(一):細(xì)胞或組織破碎
A:微生物材料
１：發(fā)酵３－４天(或?qū)?shù)生長(zhǎng)期)的菌體，離心收集菌絲體(動(dòng)植物材料無(wú)需此步處理)
２：用經(jīng)DEPC處理的水洗菌絲體２－３次，并盡量除去殘存的水
３：加液氮充分研磨，使其成為粉末，以釋放RNA
４：研磨后的樣品轉(zhuǎn)移至１２ml變性液的容器中勻漿。
B:動(dòng)植物細(xì)胞培養(yǎng)材料(適用的樣品量為細(xì)胞:108)
1:細(xì)胞或組織培養(yǎng):按常規(guī)方法進(jìn)行
2:深層懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的破碎:
(1)細(xì)胞收集:含一定濃度的細(xì)胞培養(yǎng)液置于無(wú)菌離心管中,4℃,3000g離心5分鐘
(2)細(xì)胞洗滌:上步沉淀用25毫升滅菌后冰凍的1×PBS緩沖液洗滌,然后4℃,3000g離心5分鐘,
(3)細(xì)胞破碎:在沉淀細(xì)胞中加入15毫升預(yù)冷的變性液,用無(wú)菌處理過的勻漿器勻漿
3:表面培養(yǎng)細(xì)胞的破碎:
(1)確定培養(yǎng)瓶數(shù)量,使選定的各培養(yǎng)瓶細(xì)胞累加后總量達(dá)108
(2)細(xì)胞收集:將培養(yǎng)液倒掉,用預(yù)冷的無(wú)菌PBS緩沖液洗滌一次,在培養(yǎng)瓶中加入8毫升預(yù)冷變性液,轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)瓶,使細(xì)胞溶解,此時(shí)可見粘度加大.
(3)用無(wú)菌吸管將第一個(gè)培養(yǎng)瓶中的液體吸入第二個(gè)培養(yǎng)瓶,旋轉(zhuǎn),溶解細(xì)胞,再吸入第三個(gè)培養(yǎng)瓶,以此類推,直到將所選定的培養(yǎng)瓶全部洗滌一次,然后從第一個(gè)培養(yǎng)瓶開始再加入4毫升上述變性液,將所有培養(yǎng)瓶洗一次.
(4)將上述12毫升含細(xì)胞的變性液轉(zhuǎn)移至一50毫升無(wú)菌離心管中,勻漿破碎細(xì)胞.
C:植物組織破碎(適用的樣品量為0.05g組織)
(1)將600ul變性液置于1.5ml離心管中,將此離心管放于冰浴中5分鐘.
(2)將0.05g新鮮組織用液氮冰凍
(3)在液氮下,研磨組織塊
(4)待液氮揮發(fā)后,將上述分散的組織轉(zhuǎn)移至無(wú)菌離心管中.
D:動(dòng)物組織破碎(適用的樣品量為1克組織)
(1)將12毫升變性液置于50毫升離心管中,將此離心管放于冰浴中5分鐘.
(2)在上述管中加入1克新鮮或冰凍動(dòng)物組織,勻漿粉碎.
注1:研磨組織塊用于RNA提取的樣品,必須是新鮮的細(xì)胞或組織,如采樣后,不能立即用于提取則樣品應(yīng)用液氮速凍并貯于-70℃的冰箱中保存。
2:變性液及相應(yīng)的離心管需預(yù)冷
(二):RNA的抽提
在經(jīng)變性液勻漿的細(xì)胞或組織600ul＋60ulpH4.0的2M乙酸鈉徹底混勻，可用漩渦振蕩器
600ul酚\氯仿\異戊醇(25\24\1),徹底混勻或漩渦振蕩器振蕩10秒
冰裕中10-15分鐘,
離心,4℃，10000g,20分鐘
上層水相吸至無(wú)菌離心管中 等體積的異丙醇,-70℃,30分鐘沉淀RNA
離心4℃，10000g,20分鐘
沉淀RNA,冷凍干燥15分鐘 , RNA沉淀重新溶于300ul變性液中,可振蕩(有時(shí)為了幫助溶解，可在65℃加熱，但時(shí)間應(yīng)極短)
60ulpH4.0的2M乙酸鈉徹底混勻，可用漩渦振蕩器
600ul酚\氯仿\異戊醇(25\24\1),徹底混勻或漩渦振蕩器振蕩10秒
冰裕中10-15分鐘,
離心,4℃，10000g,20分鐘
上層水相吸至無(wú)菌離心管中
等體積異丙醇二次沉淀(-70℃,30分鐘),７５％乙醇洗沉淀,沉淀冷凍干燥,復(fù)溶于去RNA酶的水中(對(duì)于準(zhǔn)備長(zhǎng)期保存的RNA可加入pH 5.0的乙酸鈉至終濃度為0.25M，再加入2.5體積的乙醇，－７０℃保存。)
注：1變性液組成：25g異硫氰酸胍溶于33mlCSB(42mM pH4.0乙酸鈉、0.83%十二烷基肌氨酸鈉、0.2mMβ-巰基乙醇)，65℃溶解，過濾滅菌，4℃預(yù)冷。
2酸性酚配制：55℃時(shí)，500g酚溶入500ml50mM,pH4.0乙酸鈉，混勻，靜止分層后，去上清，再反復(fù)加500ml50mM,pH4.0乙酸鈉,直到pH<4.1。
方法二:氯化鋰法提取總RNA
本方法用高濃度尿素變性蛋白并抑制RNA酶，用氯化鋰選擇沉淀RNA，其特別適合于從大量樣品中提取少量組織RNA，具有快速簡(jiǎn)潔的長(zhǎng)處，但也存在少量DNA的污染及RNA得率不高,小RNA片斷丟失的缺陷。
儀器：同上
試劑：
氯化鋰/尿素溶液【氯化鋰126g(3M) 尿素、360g(6M) 加水至1L，過濾滅菌】
懸浮液【10mM Tris-HCL (pH7.6) ,1mM EDTA (pH8,0) ,0.5%SDS】
其余同上
操作步驟：
1：對(duì)于大量組織或細(xì)胞，則每克組織或細(xì)胞加入5－10ml氯化鋰－尿素溶液，勻槳器高速勻槳2分鐘；對(duì)于少量細(xì)胞（107個(gè)細(xì)胞/ml），則每克組織或細(xì)胞加入0.5ml氯化鋰－尿素溶液手工勻槳，并轉(zhuǎn)移至Eppendof管中
2：勻槳液在0－4℃放置4小時(shí)后，12000g離心30分鐘
3：取沉淀，加入原勻槳液1/2體積的氯化鋰－尿素溶液，重復(fù)步驟2
4：沉淀用原勻槳液1/2體積的氯化鋰－尿素溶液復(fù)溶后，加入等體積酚/氯仿/異戊醇在室溫放置15－30分鐘并不時(shí)搖動(dòng)混勻，4000g離心5分鐘
5：取上層水相，加1/10倍體積的3M乙酸鈉（pH5.2）及2倍體積的乙醇，－20℃放置1小時(shí)，5000g離心。
6：70％乙醇洗沉淀一次。真空干燥。
7：RNA溶解液溶解沉淀，得RNA，分裝，于－70℃保存。
方法三：蛋白酶－熱酚法
本方法適合于病毒RNA的提取
儀器：同上
試劑：蛋白酶K（終濃度50ug/ml）
2×緩沖液：1%SDS 20mMTris-HCL (pH 7.6) 0.2MnaCL
其余同上
操作：
1，提純病毒液中加入等體積緩沖液、蛋白酶K,37℃40-50分鐘
2，加入等體積65℃預(yù)熱的酚溶液，輕徭,在65℃保溫5分鐘后再輕徭。
3，離心，取上清，氯仿抽提一次
4，取上層水相，加1/10倍體積的3M乙酸鈉（pH5.2）及2倍體積的乙醇，－20℃放置1小時(shí)，5000g離心(10000g,10min)。
5，70％乙醇洗沉淀一次。真空干燥。
6，RNA溶解液溶解沉淀，得RNA，分裝，于－70℃保存。
上面介紹了一些核酸（DNA、RNA）提取方法，在進(jìn)行具體實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)根據(jù)研究對(duì)象的性質(zhì)，提取核酸的用途而對(duì)上述方法在操作步驟和試劑使用量上作一定的修改。以下一些原則和建議對(duì)核酸提取的操作可能會(huì)有一定的裨益。
1：在核酸提取時(shí)，為了增加細(xì)胞的裂解度，增加核蛋白復(fù)合體破碎度，以釋放更多的游離核酸，在操作中常要用到溶菌酶和蛋白酶K，在確保沒有核酸水解酶存在的前提下，酶反應(yīng)時(shí)間越長(zhǎng)越好。
2：有時(shí)在使用蛋白酶時(shí)，為了抑制核酸水解酶的降解作用，可在蛋白酶緩沖液中用終濃度5mM的EDTA代替NaCL，并且可將反應(yīng)溫度提高到50－60℃，并將反應(yīng)時(shí)間縮短到15－25min，但酶用量必須提高10－20倍。溶菌酶使用時(shí)緩沖液中需加EDTA，因游離金屬離子對(duì)酶有抑制。
3：許多植物材料中富含酚，在細(xì)胞破碎時(shí)，在多酚氧化酶作用下，被氧化成有色的錕類物資，影響核酸的提取及降低提取質(zhì)量，在提取液中加入PVP和巰基乙醇對(duì)降低酚類的干撓可能有所幫助。PVP將與酚形成復(fù)雜的聚合體，在提取時(shí)將酚從核酸成分中游離。且PVP與巰基乙醇作為強(qiáng)還原劑可防止多酚的褐變。另外作為還原劑的這些成分在一定程度上可抑制核酸水解酶的作用。
4：許多生物材料在提取核酸時(shí)，都會(huì)遇到多糖的污染問題，具體表現(xiàn)為有機(jī)溶劑沉淀時(shí)，沉淀很多，但復(fù)溶時(shí)，大量沉淀不溶，電泳觀察時(shí)核酸含量很低。克服多糖污染可采用以下一些辦法
（1）CTAB多次抽提。
（2）在有機(jī)溶劑沉淀時(shí)先稀釋樣品濃度（可到10倍左右），對(duì)低濃度樣品再進(jìn)行沉淀。
（3）在有機(jī)溶劑沉淀時(shí)選用異丙醇和5MNaCL作為沉淀溶劑，此時(shí)氯化鈉的用量可用到1/5-1/2的體積，異丙醇可用到0.6-1的體積。異丙醇沉淀核酸時(shí)，高濃度鹽存在將使大量多糖存在在溶液中，從而可達(dá)到去多糖的作用。但高濃度的鹽存在會(huì)影響核酸的進(jìn)一步操作，因此必須用乙醇多次洗滌脫鹽。
5：在核酸提取時(shí)，酚與氯仿均起到變性的作用。酚的變性能力強(qiáng)于氯仿，但酚與水有一定的互溶，因此酚抽后，除可能損失部分核酸外，水相中還會(huì)殘留酚，而酚的存在將對(duì)核酸的酶反應(yīng)產(chǎn)生強(qiáng)的抑制，因此在操作中可單用氯仿作變性劑、也可用酚/氯仿混合變性，也可用單一酚作變性己，但用單一酚后在有機(jī)溶劑沉淀時(shí)一定要用氯仿從抽提。
6：在操作中當(dāng)加入變性劑氯仿后，為了保證核酸樣品的完整性，操作要輕，尤其在提DNA時(shí)，更要避免劇烈操作。
7：在沉淀核酸時(shí)可用乙醇與異丙醇，乙醇的極性要強(qiáng)于異丙醇，所以一般用2V乙醇沉淀，但在多糖、蛋白含量高時(shí)，用異丙醇沉淀可部分克服這種污染，尤其用異丙醇在室溫下沉淀對(duì)擺脫多糖、雜蛋白污染更為有效。
8：在提取核酸時(shí)，如樣品濃度低，則應(yīng)增加有機(jī)溶劑沉淀時(shí)間，－70℃下>30min;－20℃過夜將有助于增加核酸的沉淀量。
9：在核酸提取過程中有機(jī)溶劑沉淀后復(fù)溶時(shí)可加水因此時(shí)離子濃度可能較高，而到高度純化后低溫保存時(shí)最好復(fù)溶于TE緩沖液中，因溶于TE的核酸儲(chǔ)藏穩(wěn)定性要高于水溶液中的核酸。另外核酸樣品保存時(shí)要求以高濃度保存，低濃度的核酸樣品要比高濃度的更易降解。
10：核酸提取后可通過PCR 、RT－PCR直接擴(kuò)增出目的基因片斷，也可首先構(gòu)建文庫(kù)、然后由RACE、dd-PCR等差異顯示技術(shù)、AFLP等標(biāo)記技術(shù)、差異雜交或文庫(kù)扣除技術(shù)等方法篩選出特異探針，再用此探針從文庫(kù)中篩選出完整基因。
