核酸分子雜交技術
由于核酸分子雜交的高度特異性及檢測方法的靈敏性，它已成為分子生物學中最常用的基本技術，被廣泛應用于基因克隆的篩選，酶切圖譜的制作，基因序列的定量和定性分析及基因突變的檢測等。其基本原理是具有一定同源性的原條核酸單鏈在一定的條件下（適宜的溫室度及離子強度等）可按堿基互補原成雙鏈。雜交的雙方是待測核酸序列及探針（probe）,待測核酸序列可以是克隆的基因征段，也可以是未克隆化的基因組DNA和細胞總RNA。核酸探針是指用放射性核素、生物素或其他活性物質(zhì)標記的，能與特定的核酸序列發(fā)生特異性互補的已知DNA或RNA片段。根據(jù)其來源和性質(zhì)可分為cDNA探針、基因組探針、寡核苷酸探針、RNA探針等。
固相雜交
固相雜交（solid-phase hybridization）是將變性的DNA固定于固體基質(zhì)（硝酸纖維素膜或尼龍濾膜）上，再與探針進行雜交，故也稱為膜上印跡雜交。
斑步雜交（dot hybridization）
是道先將被測的DNA或RNA變性后固定在濾膜上然后加入過量的標記好的DNA或RNA探針進行雜交。該法的特點是操作簡單，事先不用限制性內(nèi)切酶消化或凝膠電永分離核酸樣品，可在同一張膜上同時進行多個樣品的檢測；根據(jù)斑點雜并的結(jié)果，可以推算出雜交陽性的拷貝數(shù)。該法的缺點是不能鑒定所測基因的相對分子質(zhì)量，而且特異性較差，有一定比例的假陽性。
印跡雜交（blotting hybridization）
Southern印跡雜交：凝膠電離經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化的DNA片段，將凝膠上的DNA變性并在原位將單鏈DNA片段轉(zhuǎn)移至硝基纖維素膜或其他固相支持物上，經(jīng)干烤固定，再與相對應結(jié)構(gòu)的已標記的探針進行那時交反應，用放射性自顯影或酶反應顯色，檢測特定大小分子的含量�？蛇M行克隆基因的酶切圖譜分析、基因組基因的定性及定量分析、基因突變分析及限制性長度多態(tài)性分析（RELP）等。
Northern印跡雜交:由Southerm印雜交法演變而來，其被測樣品是RNA。經(jīng)甲醛或聚乙二醛變性及電泳分離后，轉(zhuǎn)移到固相支持物上，進行雜交反應，以鑒定基中特定mRNA分子的量與大小。該法是研究基因表達常用的方法，可推臬出癌基因的表達程度。
差異雜交（differential hybridization）
是將基因組文庫的重組噬菌體DNA轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用兩種混合的不同cDNA探針（如：轉(zhuǎn)移性和非轉(zhuǎn)移性癌組織的mRNA逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA）分別與濾膜上的DNA雜交，分析兩張濾膜上對應位置雜交信息以分離差異表達的基因。適用于基因組不太復雜的真核生物（如酵母）表達基因的比較，假陽性率較低。但對基因組非常復雜的鹽酸核生物（如人），則因工作量太大，表達的序列所占百分比較低（僅5％左右），價值不大。
cDNA微點隈雜交（cDNA microarray hybridization）
是指將cDNA克隆或cDNA的PCR產(chǎn)物以高度的列陣形式排布并結(jié)合于固相支持物上（如：尼龍膜或活化的載玻片）以微點陣，然后用混合的不同DNA探針與微點陣上的DNA進行雜交。再利用熒光、化學發(fā)光、共聚焦顯微鏡等技術掃描微點陣上的雜交信息。它比差異雜交技術的效率高、速度快、成本低，適用于大規(guī)模的分析。已成商品問世。其缺點是無法克服保守的同源序列及重序?qū)﹄s交信息的干擾。
寡核苷酸微點隈雜交（oligonucleotide microarray hybridization）
是在特殊的固相支持物上原位合成寡核苷酸，使它共價結(jié)合于支持物表面，與平均長度為20-50nt的混合RNA或cDNA探針進行雜交，以提高雜交的特異性和靈敏度。應用共聚焦顯微鏡可檢測跨越三個數(shù)量級的雜交信息。適用于低豐度mRNA的檢測，以區(qū)分基因家族不同成員的差異表達特征，或鑒定同一轉(zhuǎn)錄在不同組織和細胞中的選擇性剪接。但有工作量較大、成本較高、速度較慢等弱點。
液相雜交（solution hbridization）
指使變性的待測核酸單鏈與放射笥核素標記的已知的酸單鏈（探針）在溶液中保溫，使之形成雜交復合物。反應結(jié)束后，用羥磷灰石法或酶解法將未被雜交的單鏈和雜交雙鏈分開，然后結(jié)膈后在雜妝分子中的探針量，就可推算出被測的核酸量。
遞減雜交（subtractive hybridizatio）
是利用兩種來源一致而功能不同的組織細胞提取mRNA（或逆轉(zhuǎn)錄成的cDNA）,在一定的條件下以過量的驅(qū)動mRNA或cDNA與測試的單鏈cDNA或mRNA進行液相雜交，通過羥基磷灰石柱層析篩選除去兩者間同源的雜交體。經(jīng)多輪雜交策選、除去兩者之間相同的基因成分，保留特異表達的目的基因或工基因片段。以后者篩選cDNA文庫，可獲得特異表達的目的基因cDNA全長序列。
核酸原位雜交
用特定標記的已知順序核酸作為探針與細胞級或組織切片中核酸進行復性雜交并對其實行檢測的方法，稱為核酸原位雜交（nucleic acid hybridization in situ）。用來檢測DNA在細胞核或染色休上的分布，與細胞內(nèi)RNA進行雜交以研究該組織細胞中特定基因表達水閏；還用于細胞、組織中有無特異性菌、病毒檢測的研究。
該法的優(yōu)點是特異性高，可精確定位；能在成分復雜的組織中進行單一細胞的研究而不受同一組織中其他成分的影響；不需要從組織中提取核酸，對于組織中含量極低的靶序列有極高的敏感性；并可完整地保持組織與細胞的形態(tài)。因此被廣泛應用于醫(yī)學生物學的研究，如基因定位、基因制失，基因易位、特異基因整合部物色檢測等研究。近年來由定性發(fā)展到定量，方法更為完善。
DNA分子克隆技術（也稱基因克隆技術）
在體外將DNA分子片段與載體DNA片段連接，轉(zhuǎn)入細胞獲得大量拷貝的過程中DNA分子克隆(或基因克隆)。其基本步驟包括：制備目的基因→將目的基因與載體用限制性內(nèi)切酶切割和連接，制成DNA重組→導入宿主細胞→篩選、鑒定→擴增和表達。載體（vecors）在細胞內(nèi)自我復制，并帶動重組的分子片段共同增殖，從而產(chǎn)生大量的DNA分子片段。主要目的是獲得某一基因或NDA片段的大量拷貝，有了這些與親本分子完全相同的分子克隆，就可以深入分析基因的結(jié)構(gòu)與功能，隨著引入的DNA片段不同，有兩種DNA庫，一種是基因組文庫（genomic library）,另一種是cDNA庫。
載體 所謂載體是指攜帶靶DNA片段進入宿主細胞進行擴增和表達的工具。
細菌質(zhì)粒 是一種細菌染色體外小型雙鏈環(huán)狀結(jié)構(gòu)的DNA，分子大小為1-20kb，對細菌的某些代謝活動和抗藥性表型具有一定的作用。質(zhì)粒載體是在天然質(zhì)粒的基礎上人工改造拼接而成。最常用的質(zhì)粒是pBR322。
噬菌體（phaeg） 噬菌體是感染細菌的病毒，按其生活周期分為溶菌型及溶原型兩型。用野生型λ噬菌體改造和構(gòu)建的噬菌體載體是線性雙鏈DNA，基因組約為50kb，最常用的嘵菌體為λDNA及其衍生系列。
黏性質(zhì)粒（cosmid） 是由質(zhì)粒與噬菌體λDNA組成的一種4-6kb的環(huán)狀雜種DNA。
表達型載體 將上述細菌質(zhì)粒載體或噬菌體載體接上啟動基因及多聚核糖體的基因序列組成了表達型載體。
基因庫的建造
含有某種生物體全部基歷的隨機片段的重組DNA克隆群體，其含有感光趣的基因片段的重組子，可以通過標記探針與基因庫中的重組子雜交等方法而篩選出來，所得到的克隆經(jīng)過純化和擴增，可用于進 一步的研。其主步驟包括：（1）構(gòu)建基因庫迅速的載體；(2)DNA片段的制備；（3）DNA片段與載體DNA的連接；（4）包裝和接種。
cDNA庫的建造
是指克隆的DNA片段，是由逆轉(zhuǎn)錄酶自mRNA制備的cDNA。cDNA庫包括某特定細胞的全部cDNA克隆的文庫，不含內(nèi)含子。
特異基因的篩選
常用的方法有：（1）克隆篩選即探針篩選法；（2）抗體檢測法，檢測其分泌蛋白質(zhì)來篩選目的基因；（3）放射免疫篩選法，查出分泌特異抗原的基因；（4）免疫沉淀法，進行特異基因的篩選。
核酸序列測定
DNA的堿基序列決定著基因的特性，DNA序列分析 （測序，sequencing）是分子生物學重要的基本技術。無論從基因庫中篩選的癌基因或經(jīng)PCR法擴增的基因，最終均需進行核酸序列分析，可藉以了解基因的精細結(jié)構(gòu)，獲得其限制性內(nèi)切酶圖譜，分析基因的突變及對功能的影響，幫助人工俁成基因、設計引物，以及研究腫瘤的分子發(fā)病機制等。測序是在高分辨率變性聚丙烯酰胺凝膠電泳技術的基礎上建立起來的。目前最常用的方法有Maxam-Gilbert的化學降解少和Sanger的雙脫氧法等，近年來已有DNA序列自動測定儀問世�；瘜W降解法是在DNA的片段的5`端標記核素，然后用專一性化學試劑將DNA特異地降解，在電泳和自顯影后，可得到從標記端延伸的片段供測讀序列和進行比較。一般能讀出200-250個核苷酸序列。雙脫氧法是采用核苷酸鏈終止劑，如：2`，3`-雙脫氧核苷三磷酸ddNTP(如ddTTP、ddTTP、ddGTP和ddCTP中的一種)摻入到DNA鏈中以終止鏈的延長，與摻入4種正常的dNTP的混合物分成四組進行反應，這樣可得到一組結(jié)尾長衙不一、不同專一性核苷酸鏈終止劑結(jié)尾的DNA片段，經(jīng)凝膠電泳分離和放射自顯影，可讀出合成的DNA核苷酸序列，根據(jù)堿基互補原則，可推算出模板DNA分子的序列。
化學降解法只需一化學試劑，重復性好，容易掌握；而雙脫氧法需單鏈模板、特異的寡核苷酸引物及高質(zhì)量的DNA聚合酶，便隨著M13噬菌體載體的發(fā)明和運用，合成的引物容易獲得，測序技術不斷改進，故此法已被廣泛應用�；撗醴ǖ淖詣蛹す鉄晒鉁y序儀，使測工作更快速和簡便，而且保證高度重復性。至于RNA測序現(xiàn)大多采用將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后同測序，然后反推RNA序列
聚合酶鏈反應技術
聚合酶鏈反應技術簡稱PCR技術，是一種利用DNA變性和復性原理在體外進行特定的DNA片斷高效擴增的技術，可檢出微量靶序列（甚至少到1個拷貝）。在模板DNA、引物和四種脫氧核糖核苷酸存在的條件下依賴于DNA聚合酶的酶促合成反應。僅需用極少量模板，在一對引物介導下，在數(shù)小時 內(nèi)可擴增至100萬-200萬份拷貝。PCR反應分三步：變性、退火及延伸。以上三步為一循環(huán)，每一循環(huán)的產(chǎn)物作為下一個的模板，這樣經(jīng)過九小時的循環(huán)，每一循環(huán)的產(chǎn)物作為下一個循環(huán)的模板，這樣經(jīng)過數(shù)上時的循環(huán)后，可得到大量復制的特異性DNA片段。反應條件一般為94℃變性30秒，55℃退火30秒，70-72℃延伸30-60秒，共進行30次循環(huán)左右，最后再延伸72℃5分鐘，4℃冷卻終止反應。
1.逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)用來擴增RNA的方法。
2.競爭逆轉(zhuǎn)錄PCR(competitive reverse transcription-polymerase chain rection C-RT-PCR)低豐度RNA定量的好方法。
3.多重PCR（multiples PCR）在同一PCR體系中加入多對引物可用于基天長度很長，發(fā)生多處缺失的檢測。擴增同一模板的幾個區(qū)域。
4.多種PCR可同時加入多套以生物素標記的引物起進手PCR反應。
5.反向PCR（iverse polymerase chain reaction）對一個已知的DNA片段兩側(cè)的未知序列進行擴增和研究。
6.不對稱PCR在擴增循環(huán)中引入不同引物濃度，以得到單鏈DNA并進行列測定，以了解目的基因的序列。
7.錨定PCR（anchored polymerase chain reaction）幫助克服序列未知或序列未全知帶來的障礙。在未知序列未端添加同聚物尾序，將互補的引物連接于一段帶限制性內(nèi)切酶位點的錨上，在錨引物和基因另一側(cè)特異性引物的作用下，將未知序列擴增出來。
8.著色互補試驗或熒光PCR（color complementation assay or fluorescent PCR）原理是用不同熒光染粒，分別標記于不同寡核苷酸引物上，同時擴增多個DNA片段，反應完畢后，利用分子篩選去多余的引物。用紫外線照射擴增產(chǎn)物，就能顯示某一DNA區(qū)帶熒光染料顏色的組合，如果某一DNA區(qū)帶熒光染色料顏色的組合，如果某一DNA區(qū)帶缺失，則會缺乏相應的顏色。
9.雙溫PCR（two-temperature PCR）僅僅執(zhí)行兩步溫度程序。合并退火與延伸溫度。一般常用溫度是94-95℃和46-47℃�？梢蕴岣叻磻乃俣群吞禺愋�。
上述這些PCR技術的應用：（1）PCR技術擴增特定序列為基礎，采用多種方法進行檢測，如PCR-RFLP、PCR-SSCP從已克隆的雙鏈DNA中產(chǎn)生特異性序列作為分子探針；（2）通過選擇性擴增cDNA中產(chǎn)生特異性序列作為分子探針；（2）通過選擇性擴增cDNA中的特殊片段，產(chǎn)生針對尚未克隆的基因的探針；（3）從微量mRNA中產(chǎn)生cDNA文庫；（4）產(chǎn)生大量用于序列分析的DNA；（5）分析 基因突變；（6）做染色體步移。
10.原位PCR技術：PCR雖然能擴增包括福爾馬林固定、石蠟包埋組織的各種標本的DNA，但擴增的DNA或RNA產(chǎn)物不能在組織細胞中定位，因而不能直接與特定的組織細胞特征相聯(lián)系，這是該技術一個局限性。原位雜交雖具有良好的定位能力，但由于其敏感性問題，尤其是在石蠟切片中，尚不能檢測出低含量的DNA或RNA序列。而原位PCR（In situ PCR,簡稱IS PCR），它可使擴增的特定DNA片段在分離細胞和組織切片中定位，從而彌補了PCR和原位雜交的不足，具有良好的應用前景。目前，已有多種設計的原位PCR擴增儀系統(tǒng)問世，使操作簡便，軟件靈活，已成為拉增固定細胞和石蠟包埋組織中特定DNA和RNA序列的有用工具。
IS PCR的技術特點
（1）既具有PCR的特異性與高靈敏性，又具有原位雜交的定位準確性；（2）測到低于2個拷貝量的細胞內(nèi)特定DNA序列，甚至可檢測出單一細胞中的僅含一個拷貝的原病毒DNA；（3）有助于細胞內(nèi)特定核酸序列定位與其形態(tài)學變化的結(jié)合分析；（4）可用于正�；驉盒约毎�，感染或非感染細胞的鑒定與區(qū)別。
IS PCR的基本方法
IS-PCR是PCR和原位雜交兩種技術的綾事，實質(zhì)是一種將靶DNA或RNA在原位擴增后再進行原位雜交的技術，操作程序基本兼有兩種技術的所有過程，首先在適當處理的細胞和組織切片上滴加PCR反應液，然后把載玻片放入熱循環(huán)儀中進行擴增，最后通過標記的探針進行原位雜交檢測擴增產(chǎn)物。
初步應用
有關原位PCR技術應用成功的第一篇報道是對感染綿羊中樞神經(jīng)系統(tǒng)visna病毒在綿羊脈絡從一細胞中檢查，通過PCR擴增，僅用150堿基對的短探針就可通過ISH檢查到了細胞內(nèi)的visna病毒。從開始在試管內(nèi)細胞行PCR擴增后再涂片做ISH(原位雜交)檢查，已發(fā)展到用福爾馬林固定、石蠟切片的常規(guī)病理組織方法做原位PCR檢查。有傳統(tǒng)的標記探針的原位PCR法（間接法），也有將標記物先標記PCR的引物，讓標記物擴增后再行ISH檢查的直接法。因此，目前就原位PCR方法而言，尚未能獲得統(tǒng)一，也即未能比較出哪一種方法最可靠簡便，各家報道的原位PCR技術中，在標本處理和種類上尚不同（細胞懸液、涂片、組織切片等），想檢測的靶核酸也不同（病毒或體細胞的DNA或mRNA），擴增的方法上有不同（單引物、多引物），最后顯示的方法也不同（直接法、間接法）。這些還都有待在今后的工作中積累經(jīng)驗，以求一致。
原位PCR應用的課題，目前正片于開始階段，還很局限，對人體B細胞淋巴瘤中Ig單拷貝基因重組的檢查以及對人體外周血中單核細胞HLA-DQ不同亞型的測定，歸納起來，主要應用于兩方面；（1）檢測外源懷基因片段，集中在病毒感染的檢查上，如HIV、HPV、HBV、CMV等；（2）內(nèi)源性基因片段，如人體的單基因病、重組基因、易位的染色體、Ig的mRNA片段、癌基因片段等。
基因轉(zhuǎn)染技術
將特定的遺傳信息傳遞到真核細胞中，這種能力不但革新了生物學和醫(yī)學中許多基本問題的研究，也推動了診斷和治療方面的分子技術發(fā)展，并使基因治療成為可能。目前基因轉(zhuǎn)移技術已廣泛用于基因的結(jié)構(gòu)和功能分析、基因表達與調(diào)控、基因治療與轉(zhuǎn)基因動物等研究。本部分將介紹目前基因轉(zhuǎn)移的主要方法；重點介紹基因轉(zhuǎn)移的病毒方法的基因轉(zhuǎn)染（transfection）技術。
基因運載系統(tǒng)
將某一特定的靶基因傳遞到靶細胞，需要應用某一基因運載系統(tǒng)，目前將這一系統(tǒng)概括為兩大類：非病毒辣方法和病毒方法。
1.基因轉(zhuǎn)移的非病毒方法
直接注射法 將含有DNA的溶液直接注射到肌肉，以引起鄰近的細胞攝入DNA燕進行表達，在肌細胞中，基因表達可持續(xù)數(shù)月。
磷酸鈣共沉淀法 將氯化鈣、DNA和磷酸鹽緩沖液混合，形成磷酸鈣微沉淀 ，附著于細胞膜并經(jīng)過細胞內(nèi)吞作用耐是入細胞質(zhì)。該方法的轉(zhuǎn)化效率通常很低。
脂質(zhì)體染法 指質(zhì)體能在體內(nèi)或體外提供運載外源性遺傳物質(zhì)進入細胞的載體。脂質(zhì)體介導的基因轉(zhuǎn)移的最大優(yōu)勢在于能在活體內(nèi)應用。
受體介導的基因轉(zhuǎn)移 依靠受體介導的細胞內(nèi)吞途徑以轉(zhuǎn)移外源基因。受體介導的基因轉(zhuǎn)移方法是在質(zhì)粒DNA和某種特異的多肽（配體）之間形成復合體，而這種多肽能為細胞表面的肥體所識別。如若將DNA在體內(nèi)運送至肝內(nèi)，可以選將DNA和能與肝細胞受體特異結(jié)合的去唾液酸糖蛋白質(zhì)偶聯(lián)，以便通過細胞內(nèi)吞過程而被攝入，這種DNA大部分被肝臟所攝取。應用該方法轉(zhuǎn)移的外源基因在活體內(nèi)的表達持續(xù)時間較短，在評估實際應用前影上還在一些問題。
顯微注射法 在顯微鏡下，將DNA經(jīng)同細胞玻璃針地接注入細胞，該法適合于各種培養(yǎng)生長的細胞，但需要一定的設備和操作用支巧。
電穿孔法 利用脈沖場將DNA導入培養(yǎng)細胞。
微粒子轟擊法（基因槍）近幾年發(fā)展較快的轉(zhuǎn)移方法。使用高能微粒子轟擊將DNA導入培胞或活的哺乳動物組織內(nèi)。亞微粒的鎢和金能自發(fā)地吸附DNA，將這些微彈加強速到很的速度轟擊細胞。實驗結(jié)果表明，用這種方法靶基因可在皮膚、肌肉、肝、胰、胃和乳腺等細胞中表達。
胚胎干細胞法 胚胎干細胞是從受精卵開始分裂至4個國胞階段未分化和具有多種潛能的生殖細胞，能在體外培養(yǎng)，可作為正面細胞，制備轉(zhuǎn)基因動物，以研究基因定向整合或基因剔險及基因及能。
精子載體法 最近發(fā)現(xiàn)用精子和NDA-劑孵育，可捕獲得DNA。通過受精過程，將外源性基因?qū)胧芫�，可捕獲得物物，大大間化了轉(zhuǎn)基因動物的制備過程。
2.基因轉(zhuǎn)移的病毒的方法
病毒作為基因轉(zhuǎn)移的是基因遞送有有并工具，病毒載體的優(yōu)點有：（1）在轉(zhuǎn)化的細胞中傳播重組的DNA分子作為穩(wěn)定的遺傳成分；（2）在可能將有有制陷的或突變的基因置于病毒調(diào)節(jié)信號的控制下以進行研究；（3）能將克隆的基因作為病毒微染色體的一部分 ，并能進分離；（4）轉(zhuǎn)移效率較高。其主要缺點是病毒載體對外源基因的最大容納量只有2500bp。目前常用的病毒載體有下列幾種。
逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 逆轉(zhuǎn)錄病毒辣為RNA病毒，它們的基因組編碼在一條單鏈RNA他婦上，病毒進入細胞通過逆轉(zhuǎn)錄作用，病毒RNA即轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈DNA分子，DNA進入細胞核并整合在細胞染色體中，這種整合的病毒稱為原病毒。在原病毒的兩端各有一長末端重復序列（LTR）,LTR內(nèi)側(cè)還有為復制所必需的其他順序，包括包裝信號。目前常用的逆轉(zhuǎn)病毒載體有CMV和SV。
DNA病毒載體 主要有腺病毒相關病毒載體，腺端正毒載體，皰疹病毒載體。對DNA病毒載體的研究是當前基因基因治療研究中的重點領域。
常用的基因轉(zhuǎn)染技術
將外源基因?qū)氚屑毎枰欢ǖ妮d體和導入方法，基因轉(zhuǎn)技術則是將純化的含有靶基因的質(zhì)粒DNA送入細胞內(nèi)，并在細胞內(nèi)表達。轉(zhuǎn)染方法有多種，根據(jù)不同的細胞，貼壁或懸浮細所可選用不同的方法，其目的是要達到設置轉(zhuǎn)染效率，影響轉(zhuǎn)染產(chǎn)率的因素有多種，包括轉(zhuǎn)染方法、操作技術、質(zhì)粒DNA的純度、靶細胞的生長狀態(tài)等，下面重點介紹向幾種常用的轉(zhuǎn)染技術：
靶細胞的準備 被用于作靶基因轉(zhuǎn)染的細胞，其生長狀態(tài)如何，將直接決定了基因轉(zhuǎn)染效率。如為貼壁生長的細胞，一般要求在轉(zhuǎn)染前一日，必需應用胰酶處理成單細胞懸液，重新接種于培養(yǎng)皿或瓶，細胞密度以鋪滿培養(yǎng)器皿的60%為宜，轉(zhuǎn)染當日，在轉(zhuǎn)染前4小時換一將近新鮮培養(yǎng)液。對于懸浮細胞，也需在轉(zhuǎn)染前4小時換一次新鮮培養(yǎng)液。
靶基因質(zhì)粒DNA的準備 用于轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒DNA必須無蛋白質(zhì)，無RNA和其了化學物質(zhì)的污染，OD260/280比值應在1.8以上。應用酚-氯仿抽提法制備的質(zhì)粒DNA一般難以達到此標準，目前大多采用進口的術提取純化試劑盒。
具體的基因轉(zhuǎn)染技術有鱗酸鈣介導的轉(zhuǎn)染法、DEAE葡聚糖介導轉(zhuǎn)染法、脂質(zhì)體介導轉(zhuǎn)染法及電擊基因轉(zhuǎn)導塵等。靶基因被導入細胞后，一般在轉(zhuǎn)染后48小時，靶基因即在細胞內(nèi)表達。根據(jù)不同的實驗目的，48小時后即可進行靶基因表達的檢測等實驗。如若建立穩(wěn)定的細胞系，則可對靶細胞進行篩選，根據(jù)不同基因載體中所含有的抗性標志選用相應的藥物，最常用的直核表達基因載體的標志物有潮霉素（hygromycin）和新霉素（neomycin）。
轉(zhuǎn)基因動物的建立和應用
轉(zhuǎn)基因動物是以實驗方法交源基因?qū)胨拗魇芫鸦蛟缙谂咛ゼ毎旧w基因組內(nèi)，使其穩(wěn)定整合和遺傳給后代動物。它主要采用顯微注射法、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染法、精子載體法、電轉(zhuǎn)移法與胚胎干細胞法。
轉(zhuǎn)基因動物模型的建立，推動了腫瘤在分子水平上的研究，它使人們認識到激活的原癌基因的異常表達及功能失常，是腫瘤發(fā)生的初階段。將癌基因與特定細胞的調(diào)控序列連在一起，可使癌基因在特定細胞中表達，研究靶細胞對不同癌基因的易感性，闡明某一癌基因?qū)μ囟毎L、分化及功能的影響；它還可以研究多種基因的協(xié)同作用，有助于對多步驟致癌機進行深和的探討。
轉(zhuǎn)基因小鼠不但用以研究癌基因的功能，還可以通過使某一基因功能丟失（如用基因剔除技術）研究抑癌基因在腫瘤發(fā)一中的作用。另外，轉(zhuǎn)基因小鼠對致癌原的測試，為腫瘤的預防，治療及發(fā)現(xiàn)新的致癌物質(zhì)都提供了有價值研究工具。
基因突變的檢測方法
基因突變的研已成為當今生命科學研究的熱點之一，檢測方法也隨之迅速發(fā)展。人類細胞癌基因的突變類型已如上所述，對于基因突變的檢測，1985以前，利用Southern印跡法，可以篩選出基因的缺失、插入和移碼重組等突變形式。對于用該法法不能檢測的突變，只能應用復雜費時的DNA序列測定分析法。多聚酶鏈反應（polymerase chain reaction,PCR）技術是突變研究中的最重大進展，使基因突變檢測技術有了長足的發(fā)展，目前幾乎所有的基因突變檢測的分子診斷技術都是建立于PCR的基礎之上，并且由PCR衍生出的新方法不斷出現(xiàn)，目前已達二十余種，自動化程度也愈來愈高，分析時間大大縮短，分析結(jié)果的準確性也有很大很提高。其中包括單鏈構(gòu)象多態(tài)性（single-strand comformational polymorphism,SSCP）和異源雙鏈分析法（heteroduplex analysis,HA）。下面分別介紹幾種PCR衍生技術及經(jīng)典突變檢測方法，可根據(jù)檢測目的和實驗室條件選擇時參考。
PCR-SSCP法 PCR-SSCP法是在非這性聚丙烯酰胺凝膠上，短的單鏈DNA和RNA分子依其大街基序列不同而形成不同構(gòu)象，一個堿基的改變將影響其構(gòu)象而導致其在凝膠上的移動速度改變。其基本原理為單鏈DNA在中性條件下會形成二級結(jié)構(gòu)，這種二級結(jié)構(gòu)依賴于其堿基組成，即使一個堿基的不同，也會形成不同的二級結(jié)構(gòu)而出刺同的遷移率。由于該法簡單快速，因而被廣泛用于未知基因突變的檢測。用PCR-SSCP法檢測小于200bp的PCR產(chǎn)物時，突變檢出率可達70％-95％，片段大于400bp時，檢出率僅為50％左右，該法可能會存在1％的假陽性率。應用PCR-SSCP法應注意電泳的最佳條件，一般突變類型對檢測的靈敏度無大的影響，同時該法不能測定突變的準確位點，還需通過序列分析來確定。Sarkar等認為對于大于200bp的片段，用其RNA分子來做SSCP會提高其錄敏度。應用PCR-SSCP檢測點突變已見報道于人類大部分的腫瘤組織或細胞，如乳腺癌、食管癌、肺癌、胃癌、肝癌、胰腺癌等。檢測的基因包括多種癌基因及抑癌基因，也是檢測抑癌基因p53突變最常用的方法，僅檢測第5-8外顯子即可發(fā)現(xiàn)85％以上的p53基因突變。由于該法簡便快速，特別適合大樣本基因突變研究的篩選工作。
異源雙鏈分析法（HA） HA法直接在變性凝膠上分離雜交的突變型一野生型DNA雙鏈。由于突變和野生型DNA形成的異源雜合雙鏈DNA在其錯配處會形成一突起，在非變性凝膠中電泳時，會產(chǎn)生與相應的同源雙DNA不同的遷移率。該法與SSCP相似，所不同的是SSCP分離的是單鏈DNA，HA法分離的是雙鏈DNA，也只適合于小片段的分析。但HA對一些不能用SSCP檢出的突變有互補作用，兩者結(jié)合使用，可使突變檢出率提高到近100％。
突變體富集PCR法（mutant-enriched PCR）本法的基本原理是利用ras基因家族某個密碼子部位存在已知的限制性內(nèi)切酶位點，如K-ras基因第12密碼子的BstNI位點，第13密古巴子有BgⅠⅡ位點。用鏈續(xù)二次的巢式PCR來擴增包括K-ras第12、13密碼子的DNA片段，在兩次擴增反應之間用相應的內(nèi)切酶消化擴增的DNA片段，野生型因被酶切而不能進入第二次PCR擴增，而突變型則能完整進入第二次PCR擴增并得到產(chǎn)物的富集。
變性梯度凝膠電泳法（denaturing gradinent electrophoresis,DGGE） DGGE法分析PCR產(chǎn)物，如果突變發(fā)生在最先解鏈的DNA區(qū)域，檢出率可達100％，檢測片段可達1kb，最適圍為100bp-500bp�；驹砘诋旊p鏈DNA在變性梯度凝膠中進行到與DNA變性濕度一致的凝膠位置時，DNA發(fā)生部分解鏈，電泳適移率下降，當解鏈的DNA鏈中有一個堿基改變時，會在不同的時間發(fā)生解鏈，因影響電泳速度變化的程度而被分離。由于本法是利用溫度和梯度凝膠遷移率來檢測，需要一套專用的電泳裝置，合成的PCR引物最好在5`末端加一段40bp-50bp的GC夾，以利于檢測發(fā)生于高熔點區(qū)的突變。在DGGE的基礎上，又發(fā)展了用濕度梯度代替化學變性劑的TGGE法（溫度梯度凝膠電泳temperature gradient gelelectrophoresis,TGGE）。DGGE和TGGE均有商品化的電泳裝置，該法一經(jīng)建立，操作也較簡便，適合于大樣本的檢測篩選。
化學切割錯配法（chemical cleavage of mismatch,CCM）CCM為在Maxam-Gilbert測序法的基礎上發(fā)展的一項檢測突變的技術，其檢測突變的準確性可與DNA測序相仿。其基本原理為將待測含DNA片段與相應的野生型DNA片段或DNA和RNA片段混俁變性雜交，在異源雜合的雙鏈核酸分子中，錯配的C能被羥胺或哌啶切割，錯配的T能被四氧化餓切割，經(jīng)變性凝膠電泳即可確定是否存在突變。該法檢出率很高，也是檢片段最長的方法，已有報功檢測了1.7kb片段，如果同時對正、反義鏈進行分析，檢出率可達100％。應用熒光檢測系統(tǒng)可增強敏感度，可檢測到10個細胞中的1個突變細胞。該法中的化學試劑有毒，又發(fā)展了碳二亞胺檢測法（catodiimide,CDI）,CDI為無毒物質(zhì)，也可檢測大片段DNA的點突變。
等位基因特異性寡核苷酸分析法（allele-specific oligonucleotide,ASO） ASO為一種以雜交為基礎對已知突變的檢測技術。以PCR和ASO相結(jié)合，設計一段20bp左右的寡核苷酸片段，其中包含了發(fā)生突變的部位，以此為探針，與固定在膜上的經(jīng)PCR拉增的樣品DNA雜交。可以用各種突變類型的寡核苷酸探針，同時以野生型探針為對照，如出現(xiàn)陽性雜交帶，則表運河樣品中存在與該ASO探針相應的點突變，ASO需嚴格控制雜交條件和設置標準對照避免假陽性和假陰性。目前已有商品化的檢測盒檢測部分癌基因ASO突變。
DNA芯片技術（DNA chip） DNA芯片技術是90年代后發(fā)展的一項DNA分析新技術，它集合了集成電路計算機、激光共聚焦掃描、熒光標記探針和DNA合成等先進技術�？捎糜诨蚨ㄎ�、DNA測序、物理圖譜和遺傳圖譜的構(gòu)建等。在基因突變檢測方面DNA芯片也有廣闊的前景，其基本原理為將許多已知序列的寡核苷酸DNA排列在1塊集成電路板上，彼此之間重疊1個堿基，并覆蓋全部所需檢測的基因，將熒光標記的正常DNA和突變DNA發(fā)別與2塊DNA芯片雜交，由于至少存在1個堿基的差異，正常和突變的DNA將會得到不同的雜交圖譜，經(jīng)過共聚集顯微鏡分別檢測兩種DNA分子產(chǎn)生的熒光信號，即可確定是否存在突變，該方法快速簡單、片動化程度高，具有很大的發(fā)展?jié)摿Γ瑢⒃诨蛲蛔儥z測中心發(fā)揮非常重要的作用。
連接酶鏈反應（ligase chain reaction,LCR） 與其他核酸擴增技術比較，其最大特點為可準確區(qū)分基因序列中單個基因突變，由Landegree于1988年首次應用于鐮刀獎細胞貧血的分子診斷。LCR是以DNA連接酶將某一DNA鏈的5`-磷酸與另一相鄰鏈3`-羥基連接為基礎，應用兩對互補的引物，雙鏈DNA經(jīng)加熱變性后，兩對引物分別與模板復性，若完全互補，則在連接酶的作用下，使相鄰兩引物的5`-磷酸與3`-羥基形成磷酸二酯二酯鍵而連接，前一次的連接產(chǎn)物又作為下一次循環(huán)反應的模板，如果配對的堿基存在突變則不能連接和擴增。LCR產(chǎn)物檢測最初是通過這32p標記上游引物3`未端，經(jīng)變性凝膠電泳分離后放射自顯影加以鑒定，其檢測敏感性達到200個靶分子。也可設計1個橫跨兩引物的檢測探針，用它與LCR產(chǎn)物進行雜交檢測。近年有應用熒光素、地高辛等非核素標記方法。Batt在1994年發(fā)展了一種更為簡的方法，好微孔板夾心雜交法。由于LCR的快速、特蛋和敏感的特性，以及能檢測單個堿基突變的能力，因此被應用于腫瘤基因突變的分子診斷，并與PCR結(jié)合用以提高其敏感性。
等位基因特異性擴增法（Allele-specific amplification,ASA）ASA于1989年建立，是PCR技術應用的發(fā)展，也稱擴增阻礙突變系統(tǒng)（amplification refractory mutation system,ARMS）、等位基因特性PCR（allele-specific PCR,ASPCR）等，用于對已知突變基因進行檢測。該法通過設計兩個5`端引物，一個與正常DNA互補，一個與突變DNA互補，對于純合性突變，分別加入這兩種引物及3`端引物進行兩個平行PCR，吸有與突變DNA完互補的引物才可延伸并得到PCR擴增產(chǎn)物。如果錯配位于引物的3`端則導致PCR不能延伸，則稱為ARMS。ARMS和ASPCR借鑒多重PCR原理，可在同一系統(tǒng)中同時檢測兩種或多種等位基因突變位點。ASA法的檢出率依賴于反應條件的優(yōu)化和可能發(fā)生的引物與靶DNA有氏配時錯配延伸，特別是當錯配堿基為G：T時，這時可通過調(diào)整實驗條件如引物靶DNA，Taq DNA聚合酶的濃度等來得高瓜在特異性。在反應體系中加入甲酰胺也可減少非特異性擴增。還可通過在引物3`端的第二個堿基引入一個錯配堿基，使之與模板之間形成雙重錯配以阻止錯誤延伸。
RNA酶A切割法（RNase A cleavage） 在一定條件下，氨基源雙鏈核酸分子RNA：RNA或RNA：DNA中的錯配堿基可被RNaseA切割，切割產(chǎn)物可通過變性凝膠電泳分離。當RNA探針上錯配的堿基為嘌呤時，RNaseA在錯配處的切割效率很低，甚至不切割，而當錯配堿基為嘧啶時，則其切割效率較高。故如果僅分析被檢DNA的一個條鏈，突變檢出率只有30％，如同時分析正義和反義二條鏈，檢出率可達70％。該法需要制備RNA探針，增加了操作的復雜性，但可用于1-2kb的大片段進行檢測，并能確定突變位點。于這些優(yōu)越性，它仍被作為一種經(jīng)典方法用于對未知突變進行分析。
染色體原位雜交（In situ hybridization of chromosome）染色體發(fā)現(xiàn)距今已有150多年的歷史，染色體檢測被廣泛用于動、植物及人類的細胞遺傳學研究，隨著染色體分技術和分子生物學技術的發(fā)展。染色體研究范圍也不斷擴大，特別是用于腫瘤分子診斷。腫瘤細胞的染色體變化是一非常普遍的現(xiàn)象，可分為原發(fā)和繼發(fā)兩類。在腫瘤形成的生物學基礎方面，原發(fā)性的染色體變化與引起腫瘤的直接原因有關，腫瘤細胞中可以發(fā)現(xiàn)各種形式的染色體畸變，如缺失、重復、易位、重排、單體斷裂及核內(nèi)復制等；繼發(fā)性變化主要是腫瘤細胞核型的改變。染色體的檢測對于腫瘤的診斷、鑒別診斷、生物學行為判別等方面都重要意義。染色體的檢測方法進展很快，檢測的精確率也不斷提高，這里主要介紹熒光原位雜交和PRINS法。
熒光原位雜交技術（fluorescent in situ hybridiaation,FISH）創(chuàng)建于1986年。1969年Gall和Pardue首先應用核素標記核苷酸制備探針，通過放射自顯影檢測雜交信號。應用核素標記的探針其敏感性可以檢測到中期染色體上幾百個堿基的單拷貝靶核苷酸序列，敏感性雖高，但定位不夠精確。FISH具有探針穩(wěn)定、操作安全，可快速、多色顯示多個不同探針的雜交信號等優(yōu)點。FISH的靈敏感與探針標記方法和檢測儀器性能有關，探針標記時摻入的修飾核苷酸比例直接影響雜交信號強度。FISH探針一般采用隨機引物法或切口翻譯法，如將PCR技術引入FISH探針標記，可使其靈敏度提高到0.25kb。應用慢掃描CCD配合影像處理理軟件，增強信噪比，有利于檢測微弱信號，如應用TSA系統(tǒng)（tyramide signal amplification）能將雜交信號再放大1000倍，可用于單拷貝基因的定位。FISH分辨率大約為1-3Mb,如果應用強變性劑處理染色體，讓DNA分子從蛋白質(zhì)中分離出來，使雙DNA完全伸展并粘附在玻片上，經(jīng)引處理后，分辨率可達1-2kb。還可采用對分裂中期染色體進行顯微解剖（microdissect）法以提高分辨率。FISH的另一個特點是可以聯(lián)合慶用地高辛、生物素等多種標記系統(tǒng)， 在一次雜交中可檢測多種探針在染色體上的位置及探針間的相互關系，即多色FISH或多靶FISH。FISH技術已被廣泛應用于腫瘤研究中的基因擴增、易位重排及缺失等的檢測，在腫瘤診斷和鑒別診斷、預后和治療監(jiān)控等方面都有重要意義。
Klch等于1989年發(fā)明了染色體上寡核苷酸引物原位DNA合成技術（oligonucleotide primed in situ DNA synthesis,PRINS）,并成功地用于染色體特異α衛(wèi)星DNA標記。其基本原理是用非標記的寡核苷酸引物同染色體上靶序列特異性地雜交，在DNA聚合酶作用下，當引物延伸時，摻入標記的核革酸可直接或間接地檢量標記位點。PRINS技術的優(yōu)點是不需克隆基因作探針，且由于雜交反應在前，標記在后，故非特異懷背景低。缺點是信號弱，靈敏度低，為克服這一制瞇，Terkelsen等建立了重復引物原位標記技術（repeated PRINS）,重復進行PRINS反應，使信號號強度明顯提高�；贔ISH的原理，發(fā)展了多色原位經(jīng)物標記（multicolor PRINS）,可測定二個以上靶序列在DNA分子上的相互的位置，且特異性比FISH還高。
DNA序列分析（DNA sequencing） 應用各種突變檢測技術檢測到的基因突變，最后都需用序列分析才能確定突變類型及突變位置，其效率可以達到100％�，F(xiàn)在的測序方法已與經(jīng)典的方法有了很大的不同，其基本原理雖仍是雙脫氧終止法，但自動化程度大為提高，操作更簡便，測序時間也大大縮短。隨著PCR技術與測序聯(lián)合使用，不需經(jīng)過M13亞克隆步驟，故稱為直接測序法（direct sequencing,DS）。DS法測序的模板主主要來源于PCR，應用不對稱PCR（asymmetric PCR）和基因組擴增轉(zhuǎn)錄同步測序法（genomic amplification with transcript sequencing,GAWTS）等，使單鏈產(chǎn)物大大增加。近年來，PCR循環(huán)測序法的建立，使模板擴增與同步進行，引物用四種不同前顏色的熒光標記，使每個樣品的四個測序反應可在一個反應管和一個泳道內(nèi)進行，大大提高了測鄧的自動化程度。目前PE公司推同出的DNA自動測序儀已發(fā)展到96泳道，并仍在不斷改進。這些高度自動化的測序方法是經(jīng)較理想的基因突變分析技術，但其昂貴的費用其使用范圍，所以對一些小樣本或為了某些特定目的的樣本分析，仍進行經(jīng)典的手工測序。
突變基因的檢測方法多種多樣，特別是PCR技術誕生后，許多檢測技術都是在PCR基礎上衍生的。由于PCR擴增南非要的模板量少，使對腫瘤的突變分析可以精確到單細胞，如霍奇金病的R-S細胞的單細胞基因突變分析。另外，應用顯微解剖法（microdissection）可在組織切片上較精確地挑選需檢測的靶點，其優(yōu)點是可克服腫瘤組只中間質(zhì)或癌周組織的混雜，提高準確性。除上述介紹的方法外，還有多種方法也用于基因突變的分子檢測，如對未知突變基因進行分析的酶促切割錯配法（enzyme mismatc cleavage,EMC）、切割片段長度多態(tài)性（cleavage fragment length polymor phism,CEFLP）、雙脫氧指紋圖譜法（dideoxy finger printing,ddF）、錯配接合蛋白質(zhì)截短測試法（protein truncation test,PTT）等。對已知突變基因進行分析 的有引物延伸法（primer extension,PEX）、寡核苷酸鏈接檢測法（oligonucleotide ligation assay,OLA）、毛細管電泳法（capillary electrophoresis,CE）等方法。
