制備基因組DNA是進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)和功能研究的重要步驟，通常要求得到的片段的長(zhǎng)度不小于100-200kb。在DNA提取過(guò)程中應(yīng)盡量避免使DNA斷裂和降解的各種因素，以保證DNA的完整性，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)。一般真核細(xì)胞基因組DNA有107-9bp，可以從新鮮組織、培養(yǎng)細(xì)胞或低溫保存的組織細(xì)胞中提取，常是采用在EDTA以及SDS等試劑存在下用蛋白酶K消化細(xì)胞，隨后用酚抽提而實(shí)現(xiàn)的。這一方法獲得的DNA不僅經(jīng)酶切后可用于Southern分析，還可用于PCR的模板、文庫(kù)構(gòu)建等實(shí)驗(yàn)。
根據(jù)材料來(lái)源不同，采取不同的材料處理方法，而后的DNA提取方法大體類似，但都應(yīng)考慮以下兩個(gè)原則：（1）防止和抑制DNase對(duì)DNA的降解；（2）盡量減少對(duì)溶液中DNA的機(jī)械剪切破壞。
一、試劑準(zhǔn)備
1．TE: 10mM Tris-HCl (pH 7.8); 1mM EDTA (pH 8.0)。
2．TBS: 25mM Tris-HCl (pH 7.4); 200mM NaCl; 5mM KCl。
3．裂解緩沖液：250mM SDS; 使用前加入蛋白酶K至100mg/ml。
4．20% SDS
5．2mg/ml蛋白酶K
6．Tris飽和酚（pH 8.0）、酚/氯仿（酚∶氯仿=1∶1）、氯仿
7．無(wú)水乙醇、75%乙醇
二、操作步驟
（一）材料處理
1．新鮮或冰凍組織處理：
⑴ 取組織塊0.3-0.5cm3, 剪碎，加TE 0.5ml，轉(zhuǎn)移到勻漿器中勻漿。
⑵ 將勻漿液轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管中。
⑶ 加20% SDS 25 ml，蛋白酶K (2mg/ml) 25 ml，混勻。
⑷ 60°C水浴1-3hr。
2．培養(yǎng)細(xì)胞處理：
⑴ 將培養(yǎng)細(xì)胞懸浮后，用TBS洗滌一次。
⑵ 離心4000g×5min，去除上清液。
⑶ 加10倍體積的裂解緩沖液。
⑷ 50-55°C水浴1-2hr。
（二）DNA提取
1. 加等體積飽和酚至上述樣品處理液中，溫和、充分混勻3min。
2. 離心5000g×10min，取上層水相到另一1.5ml離心管中。
3. 加等體積飽和酚，混勻，離心5000g×10min，取上層水相到另一管中。
4. 加等體積酚/氯仿，輕輕混勻，離心5000g×10min，取上層水相到另一管中。如水相仍不澄清，可重復(fù)此步驟數(shù)次。
5. 加等體積氯仿，輕輕混勻，離心5000g×10min，取上層水相到另一管中。
6. 加1/10體積的3M醋酸鈉（pH 5.2）和2.5倍體積的無(wú)水乙醇，輕輕倒置混勻。
7. 待絮狀物出現(xiàn)后，離心5000g×5min，棄上清液。
8. 沉淀用75%乙醇洗滌，離心5000g×3min ，棄上清液。
9. 室溫下?lián)]發(fā)乙醇，待沉淀將近透明后加50-100ml TE溶解過(guò)夜。
(三）DNA定量和電泳檢測(cè)
1.DNA定量：
DNA在260nm處有最大的吸收峰，蛋白質(zhì)在280nm處有最大的吸收峰，鹽和小分子則集中在230nm處。因此，可以用260nm波長(zhǎng)進(jìn)行分光測(cè)定DNA濃度，OD值為1相當(dāng)于大約50μg/ml雙鏈DNA。如用1cm光徑，用 H2O稀釋DNA樣品n倍并以H2O為空白對(duì)照，根據(jù)此時(shí)讀出的OD260值即可計(jì)算出樣品稀釋前的濃度：DNA（mg/ml）=50×OD260讀數(shù)×稀釋倍數(shù)/1000。
DNA純品的OD260/OD280為1.8，故根據(jù)OD260/OD280的值可以估計(jì)DNA的純度。若比值較高說(shuō)明含有RNA，比值較低說(shuō)明有殘余蛋白質(zhì)存在。OD230/OD260的比值應(yīng)在0.4-0.5之間，若比值較高說(shuō)明有殘余的鹽存在。
2.電泳檢測(cè)：
取1μg基因組DNA用行0.8%瓊脂糖凝膠上電泳，檢測(cè)DNA的完整性，或多個(gè)樣品的濃度是否相同。電泳結(jié)束后在點(diǎn)樣孔附近應(yīng)有單一的高分子量條帶。
三、注意事項(xiàng)
1. 所有用品均需要高溫高壓，以滅活殘余的DNA酶。
2. 所有試劑均用高壓滅菌雙蒸水配制。
3. 用大口滴管或吸頭操作，以盡量減少打斷DNA的可能性。
4. 用上述方法提取的DNA純度可以滿足一般實(shí)驗(yàn)（如Southern 雜交、PCR等）目的。如要求更高，可進(jìn)行DNA純化。
根據(jù)材料來(lái)源不同，采取不同的材料處理方法，而后的DNA提取方法大體類似，但都應(yīng)考慮以下兩個(gè)原則：（1）防止和抑制DNase對(duì)DNA的降解；（2）盡量減少對(duì)溶液中DNA的機(jī)械剪切破壞。
一、試劑準(zhǔn)備
1．TE: 10mM Tris-HCl (pH 7.8); 1mM EDTA (pH 8.0)。
2．TBS: 25mM Tris-HCl (pH 7.4); 200mM NaCl; 5mM KCl。
3．裂解緩沖液：250mM SDS; 使用前加入蛋白酶K至100mg/ml。
4．20% SDS
5．2mg/ml蛋白酶K
6．Tris飽和酚（pH 8.0）、酚/氯仿（酚∶氯仿=1∶1）、氯仿
7．無(wú)水乙醇、75%乙醇
二、操作步驟
（一）材料處理
1．新鮮或冰凍組織處理：
⑴ 取組織塊0.3-0.5cm3, 剪碎，加TE 0.5ml，轉(zhuǎn)移到勻漿器中勻漿。
⑵ 將勻漿液轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管中。
⑶ 加20% SDS 25 ml，蛋白酶K (2mg/ml) 25 ml，混勻。
⑷ 60°C水浴1-3hr。
2．培養(yǎng)細(xì)胞處理：
⑴ 將培養(yǎng)細(xì)胞懸浮后，用TBS洗滌一次。
⑵ 離心4000g×5min，去除上清液。
⑶ 加10倍體積的裂解緩沖液。
⑷ 50-55°C水浴1-2hr。
（二）DNA提取
1. 加等體積飽和酚至上述樣品處理液中，溫和、充分混勻3min。
2. 離心5000g×10min，取上層水相到另一1.5ml離心管中。
3. 加等體積飽和酚，混勻，離心5000g×10min，取上層水相到另一管中。
4. 加等體積酚/氯仿，輕輕混勻，離心5000g×10min，取上層水相到另一管中。如水相仍不澄清，可重復(fù)此步驟數(shù)次。
5. 加等體積氯仿，輕輕混勻，離心5000g×10min，取上層水相到另一管中。
6. 加1/10體積的3M醋酸鈉（pH 5.2）和2.5倍體積的無(wú)水乙醇，輕輕倒置混勻。
7. 待絮狀物出現(xiàn)后，離心5000g×5min，棄上清液。
8. 沉淀用75%乙醇洗滌，離心5000g×3min ，棄上清液。
9. 室溫下?lián)]發(fā)乙醇，待沉淀將近透明后加50-100ml TE溶解過(guò)夜。
(三）DNA定量和電泳檢測(cè)
1.DNA定量：
DNA在260nm處有最大的吸收峰，蛋白質(zhì)在280nm處有最大的吸收峰，鹽和小分子則集中在230nm處。因此，可以用260nm波長(zhǎng)進(jìn)行分光測(cè)定DNA濃度，OD值為1相當(dāng)于大約50μg/ml雙鏈DNA。如用1cm光徑，用 H2O稀釋DNA樣品n倍并以H2O為空白對(duì)照，根據(jù)此時(shí)讀出的OD260值即可計(jì)算出樣品稀釋前的濃度：DNA（mg/ml）=50×OD260讀數(shù)×稀釋倍數(shù)/1000。
DNA純品的OD260/OD280為1.8，故根據(jù)OD260/OD280的值可以估計(jì)DNA的純度。若比值較高說(shuō)明含有RNA，比值較低說(shuō)明有殘余蛋白質(zhì)存在。OD230/OD260的比值應(yīng)在0.4-0.5之間，若比值較高說(shuō)明有殘余的鹽存在。
2.電泳檢測(cè)：
取1μg基因組DNA用行0.8%瓊脂糖凝膠上電泳，檢測(cè)DNA的完整性，或多個(gè)樣品的濃度是否相同。電泳結(jié)束后在點(diǎn)樣孔附近應(yīng)有單一的高分子量條帶。
三、注意事項(xiàng)
1. 所有用品均需要高溫高壓，以滅活殘余的DNA酶。
2. 所有試劑均用高壓滅菌雙蒸水配制。
3. 用大口滴管或吸頭操作，以盡量減少打斷DNA的可能性。
4. 用上述方法提取的DNA純度可以滿足一般實(shí)驗(yàn)（如Southern 雜交、PCR等）目的。如要求更高，可進(jìn)行DNA純化。
