第一節(jié) 概 述
一. DNA的限制性內(nèi)切酶酶切分析
限制性內(nèi)切酶能特異地結(jié)合于一段被稱為限制性酶識別序列的DNA序列之內(nèi)或其附近的特異位點(diǎn)上,并切割雙鏈DNA。它可分為三類:Ⅰ類和Ⅲ類酶在同一蛋白質(zhì)分子中兼有切割和修飾(甲基化)作用且依賴于ATP的存在。Ⅰ類酶結(jié)合于識別位點(diǎn)并隨機(jī)的切割識別位點(diǎn)不遠(yuǎn)處的DNA，而Ⅲ類酶在識別位點(diǎn)上切割DNA分子,然后從底物上解離。Ⅱ類由兩種酶組成: 一種為限制性內(nèi)切核酸酶(限制酶),它切割某一特異的核苷酸序列; 另一種為獨(dú)立的甲基化酶,它修飾同一識別序列。Ⅱ類中的限制性內(nèi)切酶在分子克隆中得到了廣泛應(yīng)用，它們是重組DNA的基礎(chǔ)。絕大多數(shù)Ⅱ類限制酶識別長度為4至6個(gè)核苷酸的回文對稱特異核苷酸序列(如EcoRⅠ識別六個(gè)核苷酸序列:5'- G↓AATTC-3'),有少數(shù)酶識別更長的序列或簡并序列。Ⅱ類酶切割位點(diǎn)在識別序列中,有的在對稱軸處切割,產(chǎn)生平末端的DNA片段(如SmaⅠ:5'-CCC↓GGG-3');有的切割位點(diǎn)在對稱軸一側(cè),產(chǎn)生帶有單鏈突出末端的DNA片段稱粘性未端, 如EcoRⅠ切割識別序列后產(chǎn)生兩個(gè)互補(bǔ)的粘性末端。
5'…G↓AATTC…3' →5'… G AATTC…3'
3'…CTTAA↑G …5' →3'… CTTAA G…5'
DNA純度、緩沖液、溫度條件及限制性內(nèi)切酶本身都會(huì)影響限制性內(nèi)切酶的活性。大部分限制性內(nèi)切酶不受RNA或單鏈DNA的影響。當(dāng)微量的污染物進(jìn)入限制性內(nèi)切酶貯存液中時(shí),會(huì)影響其進(jìn)一步使用,因此在吸取限制性內(nèi)切酶時(shí),每次都要用新的吸管頭。如果采用兩種限制性內(nèi)切酶,必須要注意分別提供各自的最適鹽濃度。若兩者可用同一緩沖液,則可同時(shí)水解。若需要不同的鹽濃度,則低鹽濃度的限制性內(nèi)切酶必須首先使用,隨后調(diào)節(jié)鹽濃度,再用高鹽濃度的限制性內(nèi)切酶水解。也可在第一個(gè)酶切反應(yīng)完成后，用等體積酚/氯仿抽提，加0.1倍體積3mol/L NaAc和2倍體積無水乙醇，混勻后置-70℃低溫冰箱30分鐘，離心、干燥并重新溶于緩沖液后進(jìn)行第二個(gè)酶切反應(yīng)。
DNA限制性內(nèi)切酶酶切圖譜又稱DNA的物理圖譜，它由一系列位置確定的多種限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)組成，以直線或環(huán)狀圖式表示。在DNA序列分析、基因組的功能圖譜繪制、DNA的無性繁殖、基因文庫的構(gòu)建等工作中，建立限制性內(nèi)切酶圖譜都是不可缺少的環(huán)節(jié)，近年來發(fā)展起來的RFLP(限制性片段長度多態(tài)性)技術(shù)更是建立在它的基礎(chǔ)上。
構(gòu)建DNA限制性內(nèi)切酶圖譜有許多方法。通常結(jié)合使用多種限制性內(nèi)切酶，通過綜合分析多種酶單切及不同組合的多種酶同時(shí)切所得到的限制性片段大小來確定各種酶的酶切位點(diǎn)及其相對位置。酶切圖譜的使用價(jià)值依賴于它的準(zhǔn)確性和精確程度。
在酶切圖譜制作過程中，為了獲得條帶清晰的電泳圖譜，一般DNA用量約為0.5-1μg。限制性內(nèi)切酶的酶解反應(yīng)最適條件各不相同,各種酶有其相應(yīng)的酶切緩沖液和最適反應(yīng)溫度(大多數(shù)為37℃)。對質(zhì)粒DNA酶切反應(yīng)而言, 限制性內(nèi)切酶用量可按標(biāo)準(zhǔn)體系1μg DNA加1單位酶,消化1-2小時(shí)。但要完全酶解則必須增加酶的用量,一般增加2-3倍,甚至更多,反應(yīng)時(shí)間也要適當(dāng)延長。
二. 凝膠電泳
瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳是分離鑒定和純化DNA片段的標(biāo)準(zhǔn)方法。該技術(shù)操作簡便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度離心法）所無法分離的DNA片段。當(dāng)用低濃度的熒光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide, EB染色,在紫外光下至少可以檢出1-10ng的DNA條帶,從而可以確定DNA片段在凝膠中的位置。此外,還可以從電泳后的凝膠中回收特定的DNA條帶,用于以后的克隆操作。
瓊脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各種形狀、大小和孔隙度。瓊脂糖凝膠分離DNA片度大小范圍較廣,不同濃度瓊脂糖凝膠可分離長度從200bp至近50kb的DNA片段。瓊脂糖通常用水平裝置在強(qiáng)度和方向恒定的電場下電泳。聚丙烯酰胺分離小片段DNA(5-500bp)效果較好,其分辯力極高,甚至相差1bp的DNA片段就能分開。聚丙烯酰胺凝膠電泳很快,可容納相對大量的DNA,但制備和操作比瓊脂糖凝膠困難。聚丙烯酰胺凝膠采用垂直裝置進(jìn)行電泳。目前,一般實(shí)驗(yàn)室多用瓊脂糖水平平板凝膠電泳裝置進(jìn)行DNA電泳。
瓊脂糖主要在DNA制備電泳中作為一種固體支持基質(zhì),其密度取決于瓊脂糖的濃度。在電場中,在中性pH值下帶負(fù)電荷的DNA向陽極遷移,其遷移速率由下列多種因素決定:
1、 DNA的分子大小:
線狀雙鏈DNA分子在一定濃度瓊脂糖凝膠中的遷移速率與DNA分子量對數(shù)成反比，分子越大則所受阻力越大，也越難于在凝膠孔隙中蠕行，因而遷移得越慢。
2、 瓊脂糖濃度
一個(gè)給定大小的線狀DNA分子,其遷移速度在不同濃度的瓊脂糖凝膠中各不相同。DNA電泳遷移率的對數(shù)與凝膠濃度成線性關(guān)系。凝膠濃度的選擇取決于DNA分子的大小。分離小于0.5kb的DNA片段所需膠濃度是1.2-1.5%,分離大于10kb的DNA分子所需膠濃度為0.3-0.7%, DNA片段大小間于兩者之間則所需膠濃度為0.8-1.0%。
3、 DNA分子的構(gòu)象
當(dāng)DNA分子處于不同構(gòu)象時(shí),它在電場中移動(dòng)距離不僅和分子量有關(guān),還和它本身構(gòu)象有關(guān)。相同分子量的線狀、開環(huán)和超螺旋DNA在瓊脂糖凝膠中移動(dòng)速度是不一樣的,超螺旋DNA移動(dòng)最快,而線狀雙鏈DNA移動(dòng)最慢。如在電泳鑒定質(zhì)粒純度時(shí)發(fā)現(xiàn)凝膠上有數(shù)條DNA帶難以確定是質(zhì)粒DNA不同構(gòu)象引起還是因?yàn)楹衅渌鸇NA引起時(shí),可從瓊脂糖凝膠上將DNA帶逐個(gè)回收,用同一種限制性內(nèi)切酶分別水解,然后電泳,如在凝膠上出現(xiàn)相同的DNA圖譜,則為同一種DNA。
4、 電源電壓
在低電壓時(shí),線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。但是隨著電場強(qiáng)度的增加，不同分子量的DNA片段的遷移率將以不同的幅度增長,片段越大,因場強(qiáng)升高引起的遷移率升高幅度也越大,因此電壓增加，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍將縮小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率達(dá)到最大,所加電壓不得超過5v/cm。
5、嵌入染料的存在
熒光染料溴化乙啶用于檢測瓊脂糖凝膠中的DNA,染料會(huì)嵌入到堆積的堿基對之間并拉長線狀和帶缺口的環(huán)狀DNA，使其剛性更強(qiáng),還會(huì)使線狀DNA遷移率降低15％。
6、 離子強(qiáng)度影響
電泳緩沖液的組成及其離子強(qiáng)度影響DNA的電泳遷移率。在沒有離子存在時(shí)(如誤用蒸餾水配制凝膠),電導(dǎo)率最小,DNA幾乎不移動(dòng),在高離子強(qiáng)度的緩沖液中(如誤加10×電泳緩沖液),則電導(dǎo)很高并明顯產(chǎn)熱,嚴(yán)重時(shí)會(huì)引起凝膠熔化或DNA變性。
對于天然的雙鏈DNA,常用的幾種電泳緩沖液有TAE[含EDTA (pH8.0)和Tris-乙酸],TBE(Tris-硼酸和EDTA),TPE(Tris-磷酸和EDTA),一般配制成濃縮母液,儲(chǔ)于室溫。
第二節(jié) 材料、設(shè)備及試劑
一、 材料
λDNA: 購買或自行提取純化; 重組pBS質(zhì)料或pUC19質(zhì)粒; EcoRI酶及其酶切緩沖液: 購買成品; HindⅢ酶及其酶切緩沖液: 購買成品;瓊脂糖(Agarose): 進(jìn)口或國產(chǎn)的電泳用瓊脂糖均可。
二、 設(shè)備
水平式電泳裝置,電泳儀,臺(tái)式高速離心機(jī), 恒溫水浴鍋, 微量移液槍, 微波爐或電爐,紫外透射儀, 照相支架, 照相機(jī)及其附件。
三、 試劑
1、 5×TBE電泳緩沖液：配方見第一章。
2、 6×電泳載樣緩沖液：0.25％ 溴粉藍(lán)，40％(w/v) 蔗糖水溶液，貯存于 4℃。
3、 溴化乙錠(EB溶液母液:將EB配制成10mg/ml,用鋁箔或黑紙包裹容器,儲(chǔ)于 室溫即可。
第三節(jié) 操作步驟
一、 DNA酶切反應(yīng)
1、 將清潔干燥并經(jīng)滅菌的eppendorf管(最好0.5ml)編號,用微量移液槍分別加入DNA 1μg和相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶反應(yīng)10×緩沖液2μl,再加入重蒸水使總體積為19μl,將管內(nèi)溶液混勻后加入1μl酶液,用手指輕彈管壁使溶液混勻,也可用微量離心機(jī)甩一下,使溶液集中在管底。此步操作是整個(gè)實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵,要防止錯(cuò)加，漏加。使用限制性內(nèi)切酶時(shí)應(yīng)盡量減少其離開冰箱的時(shí)間，以免活性降低。
2、 混勻反應(yīng)體系后,將eppendorf管置于適當(dāng)?shù)闹С治锷希ㄈ绮逶谂菽芰习迳希?37℃水浴保溫2-3小時(shí),使酶切反應(yīng)完全。
3、 每管加入2μl 0.1mol/L EDTA(pH8.0),混勻,以停止反應(yīng),置于冰箱中保存?zhèn)溆谩?
二、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)的制備
采用EcoRⅠ或HindⅢ酶解所得的λDNA片段來作為電泳時(shí)的分子量標(biāo)準(zhǔn)。λDNA為長度約50kb的雙鏈DNA分子,其商品溶液濃度為0.5mg/ml,酶解反應(yīng)操作如上述。HindIII切割 DNA后得到8個(gè)片段,長度分別為23.1, 9.4, 6.6, 4.4, 2.3, 2.0, 0.56和0.12kb。EcoRI切割lDNA后得到6個(gè)片段,長度 分別為21.2, 7.4, 5.8, 5.6, 4.9和2.5kb。
三、 瓊脂糖凝膠的制備
1、 取5×TBE緩沖液20ml加水至200ml,配制成0.5×TBE稀釋緩沖液,待用。
2、 膠液的制備：稱取0.4g瓊脂糖,置于200ml錐形瓶中,加入50ml 0.5×TBE稀釋緩沖液,放入微波爐里(或電爐上)加熱至瓊脂糖全部熔化,取出搖勻,此為0.8％瓊脂糖凝膠液。加熱過程中要不時(shí)搖動(dòng),使附于瓶壁上的瓊脂糖顆粒進(jìn)入溶液。加熱時(shí)應(yīng)蓋上封口膜,以減少水份蒸發(fā)。
3、 膠板的制備：將有機(jī)玻璃膠槽兩端分別用橡皮膏(寬約1cm)緊密封住。將封好的膠槽置于水平支持物上,插上樣品梳子,注意觀察梳子齒下緣應(yīng)與膠槽底面保持1mm左右的間隙。
向冷卻至50-60℃的瓊脂糖膠液中加入溴化乙錠(EB溶液使其終濃度為0.5μg /ml(也可不把EB加入凝膠中,而是電泳后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色)。用移液器吸取少量融化的瓊脂糖凝膠封橡皮膏內(nèi)側(cè),待瓊脂糖溶液凝固后將剩余的瓊脂糖小心地倒入膠槽內(nèi),使膠液形成均勻的膠層。倒膠時(shí)的溫度不可太低,否則凝固不均勻,速度也不可太快,否則容易出現(xiàn)氣泡。待膠完全凝固后撥出梳子,注意不要損傷梳底部的凝膠,然后向槽內(nèi)加入0.5×TBE稀釋緩沖液至液面恰好沒過膠板上表面。因邊緣效應(yīng)樣品槽附近會(huì)有一些隆起,阻礙緩沖液進(jìn)入樣品槽中,所以要注意保證樣品槽中應(yīng)注滿緩沖液。
4、 加樣：取10μl酶解液與2μl 6×載樣液混勻,用微量移液槍小心加入樣品槽中。若DNA含量偏低,則可依上述比例增加上樣量,但總體積不可超過樣品槽容量。每加完一個(gè)樣品要更換tip頭,以防止互相污染,注意上樣時(shí)要小心操作,避免損壞凝膠或?qū)悠凡鄣撞磕z刺穿。
5、 電泳：加完樣后,合上電泳槽蓋,立即接通電源�？刂齐妷罕３衷�60-80V,電流在40mA以上。當(dāng)溴酚藍(lán)條帶移動(dòng)到距凝膠前沿約2cm時(shí),停止電泳。
6、 染色：未加EB的膠板在電泳完畢后移入0.5μg/ml的EB溶液中,室溫下染色20-25分鐘。
7、 觀察和拍照：在波長為254nm的長波長紫外燈下觀察染色后的或已加有EB的電泳膠板。DNA存在處顯示出肉眼可辨的桔紅色熒光條帶。紫光燈下觀察時(shí)應(yīng)戴上防護(hù)眼鏡或有機(jī)玻璃面罩,以免損傷眼睛。 經(jīng)照相機(jī)鏡頭加上近攝鏡片和紅色濾光片后將相機(jī)固定于照相架上，采用全色膠片，光圈5.6,曝光時(shí)間10-120秒(根據(jù)熒光條帶的深淺選擇)。
8、 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：在放大的電泳照片上,以樣品槽為起點(diǎn),用卡尺測量λDNA的EcoRⅠ和HindⅢ酶切片段的遷移距離,以厘米為單位。以核苷酸數(shù)的常用對數(shù)為縱坐標(biāo),以遷移距離為橫坐標(biāo),在坐標(biāo)紙上繪出連結(jié)各點(diǎn)的平滑曲線,即為該電泳條件下DNA分子量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
9、 DNA酶切片段大小的測定：在放大的電泳照片上,用卡尺量出DNA樣品各片段的遷移距離,根據(jù)此數(shù)值,在DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的對數(shù)值,進(jìn)一步計(jì)算出各片段的分子量大小(若用單對數(shù)坐標(biāo)紙來繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,則可根據(jù)遷移距離直接查出DNA片段的大小)。反之,若已知DNA片段的大小亦可由標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出它預(yù)計(jì)的遷移距離。
10、 DNA酶切片段排列順序的確定：根據(jù)單酶切,雙酶切和多酶切的電泳分析結(jié)果,對照DNA酶切片段大小的數(shù)據(jù)進(jìn)行邏輯推理,然后確定各酶切片段的排列順序和各酶切位點(diǎn)的相對位置。以環(huán)狀圖或直線圖表示,即成該DNA分子的限制性內(nèi)切酶圖譜。
[注意] 1.酶切時(shí)所加的DNA溶液體積不能太大，否則DNA溶液中其他成分會(huì)干擾酶反應(yīng)。
2、酶活力通常用酶單位（U）表示，酶單位的定義是：在最適反應(yīng)條件下，1小時(shí)完全降解1mg lDNA的酶量為一個(gè)單位，但是許多實(shí)驗(yàn)制備的DNA不象lDNA那樣易于降解，需適當(dāng)增加酶的使用量。反應(yīng)液中加入過量的酶是不合適的，除考慮成本外，酶液中的微量雜質(zhì)可能干擾隨后的反應(yīng)。
3、市場銷售的酶一般濃度很大，為節(jié)約起見，使用時(shí)可事先用酶反應(yīng)緩沖液（1×）進(jìn)行稀釋。另外，酶通常保存在50%的甘油中，實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)將反應(yīng)液中甘油濃度控制在1/10之下，否則，酶活性將受影響。
4、 觀察DNA離不開紫外透射儀,可是紫外光對DNA分子有切割作用。從膠上回收DNA時(shí),應(yīng)盡量縮短光照時(shí)間并采用長波長紫外燈(300-360nm）,以減少紫外光切割DNA。
5、 EB是強(qiáng)誘變劑并有中等毒性,配制和使用時(shí)都應(yīng)戴手套,并且不要把EB灑到桌面或地面上。凡是沾污了EB的容器或物品必須經(jīng)專門處理后才能清洗或丟棄。
6、 當(dāng)EB太多,膠染色過深,DNA帶看不清時(shí),可將膠放入蒸餾水沖泡,30分鐘后再觀察。
