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RNA分析的幾個熱點領(lǐng)域及主要技術(shù)路線

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-06-28

  DNA,RNA和蛋白質(zhì)是三種重要的生物大分子,是生命現(xiàn)象的分子基礎(chǔ);蚪MDNA中的基因通過轉(zhuǎn)錄為mRNA并進一步翻譯為蛋白質(zhì),很多種類的蛋白質(zhì)在最終發(fā)揮功能時又經(jīng)歷磷酸化、糖基化、酶原激活等翻譯后修飾。DNA的遺傳信息決定生命的主要性狀,而mRNA在信息傳遞中起很重要的作用。其它兩大類RNA,rRNA和tRNA,同樣在蛋白質(zhì)的生物合成中發(fā)揮不可替代的重要功能。因此mRNA、rRNA、tRNA在遺傳信息由DNA傳遞到表現(xiàn)生命性狀的蛋白質(zhì)的過程中舉足輕重。目前國內(nèi)外在mRNA的表達研究上如火如荼,這對于后基因組時代闡明基因的功能至關(guān)重要。

  但RNA在生命活動中的重要作用遠不止如此:很多種類的病毒直接以RNA為遺傳信息攜帶者,如SARS和AIDS等;而很多其它種類的不編碼蛋白質(zhì)的RNA分子在生命活動中起其它重要作用,如大分子生物加工和基因表達調(diào)控等。下面簡要列舉一些重要的RNA分子及其生物學意義:

  snRNA參與 mRNA剪接、 snoRNA參與rRNA成熟加工、 gRNA參與RNA編輯、SRP-RNA參與蛋白質(zhì)的分泌、端粒 RNA參與 DNA端粒合成并影響細胞的壽命、tmRNA參與破損mRNA蛋白質(zhì)合成的終止等。

gRNA(導(dǎo)引RNA):mRNA編輯
snRNA(核內(nèi)小分子RNA):mRNA加工(剪接和成熟)
snoRNA(核仁小分子RNA):rRNA加工(切割和修飾)
RNA P(RNA聚合酶):tRNA加工
Telomerase RNA:DNA復(fù)制
SRP(信號識別顆粒)-RNA:轉(zhuǎn)運
Lin-4:發(fā)育控制反義RNA(antisence RNA for development control)
rps14:核糖體生物合成反義RNA(antisence RNA for ribosome biogenesis)
dsRNA(雙鏈RNA):基因沉默(gene silence)
Xist (Xi-specific transcript)&其反義RNA Tsix:X染色體失活

  尚有很多RNA的功能還未鑒定,如很多scRNA(細胞質(zhì)小分子RNA)、用沉降系數(shù)命名的7S,10SRNA等。一些生物催化劑如核酶和轉(zhuǎn)肽酶也是RNA。

  國內(nèi)中山大學和上海生命科學院等在這些非編碼RNA的研究中做了大量工作,在國際上也占有一席之地。

  RNA的種類可能還遠不止這些,每種RNA的功能也遠不止上面提到的那么簡單。隨著研究的深入,更多種類的RNA和RNA的功能在被詮釋。因此生命科學中的一個新的學科RNA組學(RNomics)正在興起。

  勿容質(zhì)疑的現(xiàn)實是:在所有種類RNA功能等的研究中,mRNA的表達研究是最主要的熱點。特定生物的基因在不同發(fā)育階段、不同生理病理條件、不同細胞類型中的表達不盡相同,了解基因表達的開放與否和表達水平高低對闡明基因的功能至關(guān)重要。mRNA表達研究的傳統(tǒng)技術(shù)如Northern、原位雜交和定量RT-PCR等低通量技術(shù)適于少量基因的表達研究。但我們知道:參與任何一個生命過程的基因種類都有很多,因此低通量技術(shù)已經(jīng)不適合大量基因表達的研究,高通量研究基因表達的技術(shù)應(yīng)運而生,在這些技術(shù)中,DD-PCR和SSH技術(shù)操作復(fù)雜,假陽性率很高;因此近二十年來發(fā)展起來的DNA微陣列技術(shù)尤其是全基因組DNA微陣列技術(shù)目前成為獲得基因表達信息的最好技術(shù)平臺,該技術(shù)可以在盡可能短的時間內(nèi)篩選出參與一個生命過程的所有的基因的表達數(shù)據(jù)。

  DNA微陣列技術(shù)主要有兩種:cDNA微陣列和寡核苷酸微陣列。在cDNA 微陣列中,每個基因的探針為cDNA或基因的一段PCR產(chǎn)物;這種探針設(shè)計策略很難特異區(qū)分諸如RNA剪接體、重疊基因和G蛋白偶聯(lián)受體等同源基因。寡核苷酸微陣列技術(shù)又包括兩種:約70mer的寡核苷酸微陣列和Affymetrix 25mer寡核苷酸基因芯片(Genechip)。在70mer微陣列中,每個基因的探針為該基因的一段70mer的特異寡核苷酸片段。在Affymetrix基因芯片中,每個基因都有10-20個特異探針(PM探針),每個探針為25mer的寡核苷酸片段;每個探針還有對應(yīng)的錯配(MM)探針。探針特異性由大到小的排序為:25mer>70mer>cDNA。因此,Affymetrix基因芯片技術(shù)可以保證基因表達檢測的最好特異性。由于MM探針可以有效扣除總雜交信號中的背景信號,得到真正的雜交信號,因此Affymetrix基因芯片技術(shù)還可以保證基因芯片檢測的高靈敏度,這里的高靈敏度指可以檢測到低豐度表達的基因,也同時指低豐度表達的基因的表達水平發(fā)生變化時可以被檢測出來。目前看來,Affymetrix基因芯片技術(shù)可以保證基因表達檢測的最好特異性、最高靈敏度、最好的重復(fù)性和可靠性及最好的定量分析。因此Affymetrix基因芯片技術(shù)得到的基因表達信息基本沒有必要通過定量RT-PCR、原位雜交和Northern等技術(shù)來驗證。

  當然,Affymetrix基因芯片技術(shù)的局限性在于該技術(shù)依賴基因組序列信息。如果一個物種的基因組序列信息已知,Affymetrix就可以通過生物信息學等設(shè)計代表每一個基因的特異的探針。盡管Affymetrix芯片涉及的物種已經(jīng)居全球首位(Affymetrix公司目前能提供的芯片物種信息見本刊后面的專題介紹),由于很多生物沒有基因組序列信息,高通量研究這些生物的基因表達信息還只能依賴構(gòu)建cDNA文庫并制作cDNA微陣列,這樣得到的基因表達信息需要通過定量RT-PCR、原位雜交和Northern等技術(shù)來驗證。

  基因芯片得到的基因表達數(shù)據(jù)很豐富,通過生物信息學可以得到其中最具有價值的信息,比如哪些基因可能與研究者研究的生理或病理現(xiàn)象直接相關(guān)。對于這些重要基因的功能的研究,下一步的技術(shù)包括RNAi(本刊中有多篇專題介紹),基因敲除和轉(zhuǎn)基因技術(shù)等。而基因功能的最終闡明需要結(jié)合蛋白質(zhì)(組)的研究等。

最后需要指出的是,不同細胞類型在不同生理或病理條件下或在不同的發(fā)育階段,其基因表達情況不盡相同,如果采取勻漿技術(shù)獲得含多種類型細胞的組織中的mRNA并雜交基因芯片,那么得到的數(shù)據(jù)無法精確解釋每一類細胞的基因表達情況。建立細胞類型特異性的基因表達數(shù)據(jù)對研究生命現(xiàn)象的分子機理很重要,可以通過激光顯微切割(laser microdissection, LMD,詳見本刊專題介紹)技術(shù)將一個組織中不同類型的細胞進行分離,從不同細胞類型中分別得到各自的mRNA,然后分別雜交基因芯片。當然,LMD技術(shù)對建立細胞特異性的蛋白質(zhì)表達數(shù)據(jù)信息也至關(guān)重要。

 
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