真核生物中，從個(gè)體的生長(zhǎng)、發(fā)育、衰老、死亡，到組織的分化、凋亡以及細(xì)胞對(duì)各種生物、理化因子的應(yīng)答，本質(zhì)上都涉及基因的選擇性表達(dá)。高等生物大約有30 000個(gè)不同的基因，但在生物體內(nèi)任意細(xì)胞中只有10%的基因得以表達(dá)，而這些基因的表達(dá)是按事件和空間順序有序地進(jìn)行著，這種表達(dá)的方式即為基因的差異表達(dá)。其包括新出現(xiàn)的基因表達(dá)與表達(dá)量有差異的基因表達(dá)。生物體表現(xiàn)出的各種特性，主要是由于基因的差異表達(dá)引起的。由于基因差異表達(dá)的變化是調(diào)控細(xì)胞生命活動(dòng)過(guò)程的核心機(jī)制，通過(guò)比較同一類細(xì)胞在不同生理?xiàng)l件下或在不同生長(zhǎng)發(fā)育階段的基因表達(dá)差異，可為分析生命活動(dòng)過(guò)程提供重要信息。
研究基因差異表達(dá)的主要技術(shù)有差別雜交（篩選）（differential hybridization）、扣除（消減）雜交（subtractive hybridization of cDNA， SHD）、mRNA差異顯示（mRNA differential display， DD）、抑制消減雜交法（suppression subtractive hybridization， SSH）、代表性差異分析（represential display analysis， RDA）、交互扣除ＲＮＡ差別顯示技術(shù)（reciprocal subtraction differential RNA display）以及基因表達(dá)系列（serial analysis of gene expression， SAGE）分析和電子消減（electronic subtraction）和DNA微列陣分析（DNA microarray）等。
這里我們重點(diǎn)介紹傳統(tǒng)mRNA差異顯示技術(shù)（DDRT-PCR）和第二代差異顯示系統(tǒng)：限制性酶切片段差異顯示（RFDD-PCR）
傳統(tǒng)mRNA差異顯示技術(shù)（DDRT-PCR）是根據(jù)絕大多數(shù)真核細(xì)胞mRNA3'端具有的多聚腺苷酸尾（polyA）結(jié)構(gòu)，因此可用含oligo（dT）的寡聚核苷酸為引物將不同的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。該方法的創(chuàng)始人Liang P和Pardee A根據(jù)Poly A序列起點(diǎn)前2個(gè)堿基除AA外只有12種可能性的特征，設(shè)計(jì)合成了12種下游引物，稱3′-錨定引物，其通式為5'-T11MN；同時(shí)為擴(kuò)增出polyA上游500bp以內(nèi)所有可能性的mRNA序列，在5′端又設(shè)計(jì)了20種10bp長(zhǎng)的隨機(jī)引物。這樣構(gòu)成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增能產(chǎn)生出20000條左右的DNA條帶，其中每一條都代表一種特定mRNA種，這一數(shù)字大體涵蓋了在一定發(fā)育階段某種細(xì)胞類型中所表達(dá)的全部mRNA。將差別表達(dá)條帶中的DNA回收，擴(kuò)增至所需含量，進(jìn)行Southernblot或Northernblot或直接測(cè)序，從而對(duì)差異條帶鑒定分析，以便最終獲得差異表達(dá)的目的基因。
原理見(jiàn)下圖：
雖然mRNA差別顯示技術(shù)（DDRT-PCR）具有很多優(yōu)點(diǎn):1)速度快,較易操作;2)由于PCR擴(kuò)增技術(shù)的應(yīng)用,使得低豐度mRNA的鑒定成為可能,且靈敏度高;3)可同時(shí)比較兩種以上不同來(lái)源的mRNA樣品間基因表達(dá)的差異。但在實(shí)際操作中仍存在一些問(wèn)題,主要表現(xiàn)在:
1)出現(xiàn)差別條帶太多,假陽(yáng)性率高達(dá)70%左右,重復(fù)性差,且對(duì)高拷貝數(shù)的mRNA具很強(qiáng)的傾向性;
2）在有差異的顯示片段中難以知道哪個(gè)基因是已經(jīng)研究過(guò)的，哪些是未知基因
3)得到的有差異的擴(kuò)增條帶短,一般在110～450bp之間；
4）以poly(A)為引物的PCR擴(kuò)增只適合真核生物。
所以差別顯示技術(shù)自1992年建立后，一直在不斷進(jìn)行著改進(jìn)。第二代差異顯示系統(tǒng):限制性酶切片段差異顯示（RFDD-PCR）就是一個(gè)很有效的改進(jìn)。
RFDD-PCR不是直接擴(kuò)增cDNA,而是首先限制性酶切cDNA，再在酶切后的cDNA片段兩邊加上特殊接頭進(jìn)行擴(kuò)增。正是RFDD-PCR系統(tǒng)使用了一系列特殊接頭和引物，特異性PCR引物的使用和下游的PCR反應(yīng)使RFDD-PCR分析具有高度的重復(fù)性，解決了第一代差別顯示系統(tǒng)的重復(fù)性問(wèn)題；因?yàn)镽FDD-PCR技術(shù)不使用以poly(A)為引物的PCR擴(kuò)增，因而該系統(tǒng)對(duì)原核和真核系統(tǒng)皆適用；在第一代的差異顯示系統(tǒng)中，下游引物特異性結(jié)合poly(A)尾，因此與3'端未翻譯區(qū)域相對(duì)應(yīng)的差異表達(dá)序列大部分被鑒別出，而RFDD-PCR 采用優(yōu)先切割翻譯序列的限制性內(nèi)切酶（如TaqI），因此可以優(yōu)先展示編碼區(qū)，更加適合于下游功能分析；使用RFDD-PCR或得差異顯示基因后，與disploy Fit網(wǎng)絡(luò)相連后，可以確定哪個(gè)基因是已經(jīng)研究過(guò)的，哪些是未知基因，對(duì)下一步研究有很好的知道意義。總之，RFDD-PCR中高度嚴(yán)謹(jǐn)?shù)腜CR可以產(chǎn)生結(jié)果一致的基因表達(dá)圖譜，重點(diǎn)放大和展示編碼區(qū)，對(duì)原核及真核RNA都有用，大大消除假陽(yáng)性。原理見(jiàn)下圖
