一、激光掃描共聚焦顯微鏡的基本原理和發(fā)展

科學(xué)研究工作對(duì)更高圖像分辨率的追求產(chǎn)生了激光掃描共聚焦顯微鏡。隨著免疫熒光技術(shù)在生物學(xué)研究領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，研究人員注意到，熒光顯微照片的分辨率較低，傳統(tǒng)的熒光顯微鏡使用場(chǎng)光源，因標(biāo)本鄰近結(jié)構(gòu)（細(xì)胞或亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)）產(chǎn)生的衍射光和散射光的干擾，使標(biāo)本中細(xì)微結(jié)構(gòu)的成像不夠清晰。激光共聚焦顯微鏡的主要原理是利用激光掃描束通過(guò)光柵針孔形成點(diǎn)光源，在熒光標(biāo)記標(biāo)本的焦平面上逐點(diǎn)掃描，采集點(diǎn)的光信號(hào)通過(guò)探測(cè)針孔到達(dá)光電倍增管（PMT），再經(jīng)過(guò)信號(hào)處理，在計(jì)算機(jī)監(jiān)視屏上形成圖像。由于激光光源的光柵針孔和探測(cè)針孔對(duì)物鏡焦平面是共軛的，焦平面上的點(diǎn)同時(shí)聚焦于光柵針孔和探測(cè)針孔，進(jìn)行點(diǎn)掃描時(shí)，掃描點(diǎn)以外的點(diǎn)不會(huì)成像，經(jīng)逐點(diǎn)掃描后才形成整個(gè)標(biāo)本的光學(xué)切片（Optic section）。

二、圖像激光掃描共聚焦顯微鏡的主要生物學(xué)應(yīng)用

1 、組織和細(xì)胞中熒光標(biāo)記的分子和結(jié)構(gòu)的檢測(cè)

標(biāo)本制備方法主要有免疫熒光組織和細(xì)胞化學(xué)法、熒光蛋白標(biāo)記分子法、熒光細(xì)胞染料標(biāo)記法等。與傳統(tǒng)的熒光顯微鏡相比，除了有較高的分辨率以外，一個(gè)主要的不同是激光掃描共聚焦顯微鏡可以利用激光點(diǎn)掃描成像，形成所謂的“光學(xué)切片”，進(jìn)而可以利用沿縱軸上移動(dòng)標(biāo)本進(jìn)行多個(gè)光學(xué)切片的疊加形成組織或細(xì)胞中熒光標(biāo)記結(jié)構(gòu)的總體圖像，因此可以用于觀察切片和一些表面不平的標(biāo)本，特別是研究具有長(zhǎng)突起的神經(jīng)元時(shí)更有使用價(jià)值。同時(shí)可以做三維圖像重建和標(biāo)記強(qiáng)度的半定量分析。

2、定量或半定量測(cè)量Ca2+和pH等細(xì)胞內(nèi)離子濃度及變化

利用Fluo23 、Fura2等熒光探針可以測(cè)量Ca2+在活細(xì)胞內(nèi)的濃度及變化。一般來(lái)說(shuō)，電生理記錄裝置加攝像技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)離子量變化的速度相對(duì)較快，但其圖像本身的價(jià)值較低，而激光掃描共聚焦顯微鏡可以提供更好的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中鈣離子濃度動(dòng)態(tài)變化的圖像，這對(duì)于研究鈣等離子細(xì)胞內(nèi)動(dòng)力學(xué)有意義。最好與電生理等技術(shù)相結(jié)合來(lái)觀察離子變化與電生理學(xué)指標(biāo)的相關(guān)性。

3、熒光光漂白及恢復(fù)技術(shù)

利用高能量激光束將細(xì)胞內(nèi)某一部分中選定靶區(qū)域的某種熒光淬滅，然后觀察鄰近相同的熒光標(biāo)記物重新擴(kuò)散入該區(qū)域的速度和方式，從而分析細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)運(yùn)輸、受體在細(xì)胞膜上的流動(dòng)和大分子組裝等細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程。一般來(lái)說(shuō)，需要用熒光蛋白等標(biāo)記物標(biāo)記需要研究的分子，進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染表達(dá)后再做以上的實(shí)驗(yàn)。

4、長(zhǎng)時(shí)程觀察細(xì)胞遷移和生長(zhǎng)

目前激光掃描共聚焦顯微鏡的軟件一般均可自動(dòng)控制地進(jìn)行定時(shí)和定方式的激光掃描，而且由于新一代激光掃描共聚焦顯微鏡的探測(cè)效率的提高，只需要很小的激光能量就可以達(dá)到較好的圖像質(zhì)量，從而減小了每次掃描時(shí)激光束對(duì)細(xì)胞的損傷，因此，可以用于數(shù)小時(shí)的長(zhǎng)時(shí)程定時(shí)掃描，記錄細(xì)胞遷移和生長(zhǎng)等細(xì)胞生物學(xué)現(xiàn)象。

5、其他的生物學(xué)應(yīng)用

用高能量激光束進(jìn)行細(xì)胞損傷和損毀實(shí)驗(yàn)，一般要用紫外激光束進(jìn)行細(xì)胞損毀；細(xì)胞間通訊研究；光解籠鎖活化技術(shù)等。

三、激光共聚焦顯微鏡在以下研究領(lǐng)域中應(yīng)用較為廣泛

1、細(xì)胞生物學(xué)：細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞骨架、細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、流動(dòng)性、受體、細(xì)胞器結(jié)構(gòu)和分布變化、細(xì)胞凋亡；

2、生物化學(xué)：酶、核酸、FISH、受體分析；

3、藥理學(xué)：藥物對(duì)細(xì)胞的作用及其動(dòng)力學(xué)；

4、生理學(xué)：膜受體、離子通道、離子含量、分布、動(dòng)態(tài)；

5、遺傳學(xué)和組胚學(xué)：細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、成熟變化、細(xì)胞的三維結(jié)構(gòu)、染色體分析、基因表達(dá)、基因診斷；

6、神經(jīng)生物學(xué)：神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)、神經(jīng)遞質(zhì)的成分、運(yùn)輸和傳遞；

7、微生物學(xué)和寄生蟲(chóng)學(xué)：細(xì)菌、寄生蟲(chóng)形態(tài)結(jié)構(gòu)；

8、病理學(xué)及病理學(xué)臨床應(yīng)用：活檢標(biāo)本的快速診斷、腫瘤診斷、自身免疫性疾病的診斷；

9、生物學(xué)、免疫學(xué)、環(huán)境醫(yī)學(xué)和營(yíng)養(yǎng)學(xué)。