一、熒光顯微鏡標(biāo)本制作要求
1.載玻片
載玻片厚度應(yīng)在0.8～1.2mm之間，太厚的坡片，一方面光吸收多，另一方面不能使激發(fā)光在標(biāo)本上聚集。載玻片必須光潔，厚度均勻，無(wú)明顯自發(fā)熒光。有時(shí)需用石英玻璃載玻片。
2.蓋玻片
蓋玻片厚度在0.17mm左右，光潔。為了加強(qiáng)激發(fā)光，也可用干澀蓋玻片，這是一種特制的表面鍍有若干層對(duì)不同波長(zhǎng)的光起不同干涉作用的物質(zhì)（如氟化鎂）的蓋玻片，它可以使熒光順利通過(guò)，而反射激發(fā)光，這種反射的激發(fā)光可激發(fā)標(biāo)本。
3.標(biāo)本
組織切片或其他標(biāo)本不能太厚，如太厚激發(fā)光大部分消耗在標(biāo)本下部，而物鏡直接觀察到的上部不能被充分激發(fā)。另外，細(xì)胞重疊或雜質(zhì)掩蓋，影響判斷。
4.封裱劑
封裱劑常用甘油，必須無(wú)自發(fā)熒光，無(wú)色透明，熒光的亮度在PH8.5～9.5時(shí)較亮，不易很快褪去。所以，常用甘油和0.5mol/L PH9.0～9.5的碳酸鹽緩沖液的等量混合液作封裱劑。
5.鏡油
一般用暗視野熒光顯微鏡和油鏡觀察標(biāo)本時(shí)，必須使用鏡油。最好使用特制的無(wú)熒光鏡油，也可用上述甘油代替，液體石蠟也可用，只是折光率較低，對(duì)圖像質(zhì)量略有影響。
二、熒光顯微鏡基本操作
1.關(guān)閉房間內(nèi)的電燈，開(kāi)啟顯微鏡汞燈；
2.根據(jù)樣品標(biāo)記的熒光素選擇相應(yīng)的濾光片；
3.放好樣品，找到合適的視野；
4.如需拍照，請(qǐng)確認(rèn)照相機(jī)內(nèi)已裝好彩色膠卷（最好使用27定膠卷）；
5.開(kāi)啟自拍裝置，選擇手動(dòng)檔，通常拍攝速度在0.5-10秒內(nèi)；
6.使用結(jié)束，關(guān)閉所有電源并做好使用記錄。
三、熒光圖像的記錄方法
熒光顯微鏡所看到的熒光圖像，一是具有形態(tài)學(xué)特征，二是具有熒光的顏色和亮度，在判斷結(jié)果時(shí)，必須將二者結(jié)合起來(lái)綜合判斷。結(jié)果記錄根據(jù)主觀指標(biāo)，即憑工作者目力觀察。作為一般定性觀察，基本上可靠的。隨著技術(shù)科學(xué)的發(fā)展，在不同程度上采用客觀指標(biāo)記錄判斷結(jié)果，如用細(xì)胞分光光度計(jì)，圖像分析儀等儀器。但這些儀器記錄的結(jié)果，也必須結(jié)合主觀的判斷。
熒光顯微鏡攝影技術(shù)對(duì)于記錄熒光圖像十分必要，由于熒光很易褪色減弱，要即時(shí)攝影記錄結(jié)果。方法與普通顯微攝影技術(shù)基本相同。只是需要采用高速感光膠片即可。因紫外光對(duì)熒光猝滅作用大，如FITC的標(biāo)記物，在紫外光下照射30s，熒光亮度降低50%。所以，曝光速度太慢，就不能將熒光圖像拍攝下來(lái)。一般研究型熒光顯微鏡都有半自動(dòng)或全自動(dòng)顯微攝影系統(tǒng)裝置。
四、使用熒光顯微鏡的注意事項(xiàng)
1.嚴(yán)格按照熒光顯微鏡出廠說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行操作，不要隨意改變程序。
2.應(yīng)在暗室中進(jìn)行檢查。進(jìn)入暗室后，接上電源，點(diǎn)燃超高壓汞燈5～15min，待光源發(fā)出強(qiáng)光穩(wěn)定后，眼睛完全適應(yīng)暗室，再開(kāi)始觀察標(biāo)本。
3.防止紫外線對(duì)眼睛的損害，在調(diào)整光源時(shí)應(yīng)戴上防護(hù)眼鏡。
4.檢查時(shí)間每次以1～2h為宜，超過(guò)90min，超高壓汞燈發(fā)光強(qiáng)度逐漸下降，熒光減弱；標(biāo)本受紫外線照射3～5min后，熒光也明顯減弱；所以，最多不得超過(guò)2～3h。
5.熒光顯微鏡光源壽命有限，標(biāo)本應(yīng)集中檢查，以節(jié)省時(shí)間，保護(hù)光源。天熱時(shí)，應(yīng)加電扇散熱降溫，新?lián)Q燈泡應(yīng)從開(kāi)始就記錄使用時(shí)間。燈熄滅后欲再用時(shí)，須待燈泡充分冷卻后才能點(diǎn)燃。一天中應(yīng)避免數(shù)次點(diǎn)燃光源。
6.標(biāo)本染色后立即觀察，因時(shí)間久了熒光會(huì)逐漸減弱。若將標(biāo)本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延緩熒光減弱時(shí)間，防止封裱劑蒸發(fā)。
7.熒光亮度的判斷標(biāo)準(zhǔn)：一般分為四級(jí)，即“-”指無(wú)或可見(jiàn)微弱熒光。“+”指僅能見(jiàn)明確可見(jiàn)的熒光。“++”指可見(jiàn)有明亮的熒光。“+++”指可見(jiàn)耀眼的熒光。