目的 探討食品添加劑KBrO3對(duì)哺乳類組織中82羥基鳥嘌呤糖基酶的氧化誘導(dǎo)作用。方法 比較用KBrO3處理大鼠后,其腎和肝中修復(fù)酶活性的變化規(guī)律。酶活性分析用高效液相色譜P電化學(xué)檢測(cè)法。結(jié)果 腹膜下給予80mgPkg劑量KBrO3后,在腎臟發(fā)現(xiàn)酶活性在3h時(shí)顯著升高,而在6h時(shí),其活性達(dá)到高大值(1.25±0.14)pmol,該值是0h的6倍。然后,活性開始下降并在12h回到0h水平;不加處理時(shí),其活性只有(0.20±0.06)pmol,而在20、40、80及160mgPkgKBrO3腹膜下給予時(shí),其活性分別是(0.33±0.09)、(0.53±0.10)、(0.75±0.13)及(1.30±0.08)pmol,在40mgPkg以上時(shí)活性顯著增高,且顯示劑量反應(yīng)關(guān)系。在腎中觀察到該酶活性變化是時(shí)間與劑量依賴性的,而在肝中未發(fā)現(xiàn)這種變化。結(jié)論 哺乳類組織中82羥基鳥嘌呤糖基酶能被氧化誘導(dǎo),提示DNA中氧化損傷的修復(fù)是機(jī)體在有氧環(huán)境中生存的重要過(guò)程。
DNA中的鳥嘌呤容易被活性氧自由基羥化成為8-羥基鳥嘌呤,這種堿基改變能誘導(dǎo)GCyTA轉(zhuǎn)化,已證實(shí)DNA氧化損傷與心血管疾病、老化等慢性病有關(guān)。因此生物體存在預(yù)防8-羥基鳥嘌呤所致遺傳結(jié)構(gòu)完整性損害的防御機(jī)制。
8-羥基鳥嘌呤內(nèi)切酶同時(shí)具有8-羥基鳥嘌呤糖基酶活性及腺嘌呤核酸內(nèi)切酶活性,該酶分兩步修復(fù)DNA中82羥基鳥嘌呤,先將82羥基鳥嘌呤當(dāng)成自由堿基移去,然后在腺嘌呤位點(diǎn)切開磷酸二酸鍵的3c和5c端。
最近發(fā)現(xiàn)大腸埃希菌的8-羥基鳥嘌呤內(nèi)切酶(糖基酶)能受氧張力增高的誘導(dǎo),該酶的適應(yīng)性反應(yīng)使其在氧化刺激下能發(fā)揮更有效的對(duì)抗DNA氧化損傷的作用。至今尚未見(jiàn)有哺乳類組織82羥基鳥嘌呤糖基酶誘導(dǎo)的研究。因此,我們嘗試在大鼠經(jīng)KBrO3處理后,其肝和腎中8-羥基鳥嘌呤糖基酶的活性改變。KBrO3是一種選擇性作用于腎臟的氧化性致癌物。在本研究中,僅發(fā)現(xiàn)腎臟8-羥基鳥嘌呤糖基酶的活性被氧化誘導(dǎo),而肝中未被誘導(dǎo)。腎臟中活性增高呈現(xiàn)劑量和時(shí)間依賴性。
1 材料和方法
1.1 寡脫氧核苷酸作為底物
用于82羥基鳥嘌呤糖基酶的寡脫氧核苷酸的合成按照Kuchino等描述的方法(1987年)。
1.2 以[14C]82羥基鳥嘌呤作為內(nèi)標(biāo)物
82羥基鳥嘌呤定量的內(nèi)標(biāo)物[14C]82羥基鳥嘌呤用[14C]鳥嘌呤制備,按照Degan等描述的程序(1991年)。
1.3 以KBrO3作用于動(dòng)物
0.9%KBrO3鹽水通過(guò)腹膜內(nèi)注射雄性Fisher大鼠,大鼠體重約120g。給藥前大鼠禁食一夜,為觀察KBrO3作用的時(shí)間效應(yīng),采用80mgPkg劑量;按24h時(shí)間間隔殺死大鼠。為觀察KBrO3作用的劑量效應(yīng),按不同劑量,最高至160mgPkg給藥,給藥后9h殺死,分離其腎和肝來(lái)制備組織抽提物。
1.4 組織提取物制備
取出大鼠的腎和肝用0.9%冷鹽水沖去殘血,腎、肝用液氮冷卻貯存于-70e備用,用2倍體積的勻漿緩沖液研磨和勻漿冷凍器官,懸浮的勻漿用1.5%的鏈霉素混合,以除去核酸,離心后上清液透析,用作82羥基鳥嘌呤糖基酶分析的組織提取物。上述步驟在4e以下操作。
1.5 酶分析
將4pmol雙鏈DNA底物同5mg上述腎和肝的提取物在30e下孵化2h,1ml反應(yīng)混合物包括50mmolPLTris2HCl、50mmolPLKCl及1mmolPLEDTA,pH值為7.5,通過(guò)90e加熱3min來(lái)終止反應(yīng),按6000rPmin離心10min,取900Ll上清液加100Ll約400次Pmin14C8-羥基鳥嘌呤內(nèi)標(biāo)液,該混合物加入經(jīng)8-羥基鳥嘌呤單克隆抗體制備的免疫親和柱。經(jīng)純化的82羥基鳥嘌呤溶于50Ll水,注入5Lm,416mmx25cmHPLC柱,進(jìn)行高效液相色譜、電化學(xué)檢測(cè)分析,測(cè)量電化學(xué)檢測(cè)器上顯示的82羥基鳥嘌呤峰高及8-羥基鳥嘌呤洗提液的放射活性,峰高用于82羥基鳥嘌呤的定量,是反應(yīng)介質(zhì)和加入14C282羥基鳥嘌呤的總和。從總量中減去內(nèi)標(biāo)物即得到原反應(yīng)介質(zhì)中8-羥基鳥嘌呤的量。所加14C282羥基鳥嘌呤可通過(guò)校準(zhǔn)曲線比較其峰高與放射活性來(lái)定量。洗提液的放射活性可用來(lái)定量在免疫親和柱純化過(guò)程中8-羥基鳥嘌呤的損失量。加入1ml反應(yīng)介質(zhì)中的8-羥基鳥嘌呤的量可利用損失率和反應(yīng)介質(zhì)中8-羥基鳥嘌呤的原始量來(lái)測(cè)定,酶活性可表達(dá)為在上述反應(yīng)條件下DNA底物中釋放出來(lái)的8-羥基鳥嘌呤的含量,數(shù)據(jù)可表達(dá)為6次實(shí)驗(yàn)的均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。統(tǒng)計(jì)分析用t檢驗(yàn)。
2 結(jié)果
KBrO3對(duì)82羥基鳥嘌呤糖基酶活性的影響效應(yīng)可通過(guò)腎與肝中含量的時(shí)間及劑量效應(yīng)來(lái)表達(dá)。為比較起見(jiàn),腎臟被選作靶器官,肝臟作控制對(duì)比。圖1顯示腹膜內(nèi)給予80mgPkg劑量KBrO3后,兩種器官中82羥基鳥嘌呤含量的時(shí)間效應(yīng)關(guān)系,在腎臟,發(fā)現(xiàn)其活性在3h[(0.73±0.14)pmol]時(shí)顯著升高,相比之下,在0h活性只有(0.20±0.06)pmol,而在6h時(shí),其活性達(dá)到高大值(1.25±0.14)pmol,該值是0時(shí)的6倍。然后,活性開始下降并在12h回到0h水平;作為對(duì)比,肝中活性在相同時(shí)間段并無(wú)顯著變化。圖2顯示其活性與KBrO3劑量的關(guān)系,不加處理時(shí),活性只有(0.20±0.06)pmol,而在20、40、80及160mgPkgKBrO3腹膜下給予時(shí),其活性分別是(0.33±0.09)、(0.53±0.10)、(0.75±0.13)及(1.30±0.08)pmol,在40mgPkg以上時(shí)活性顯著增高,且顯示劑量反應(yīng)關(guān)系,而肝中活性在相同的劑量范圍內(nèi)并無(wú)顯著變化。