1、通過已知基因產(chǎn)物的分析和鑒定
這類技術(shù)主要通過生物化學(xué)和病理學(xué)研究分離鑒定有關(guān)基因的蛋白產(chǎn)物，并對(duì)蛋白質(zhì)氨基酸順序進(jìn)行分析，推斷出編碼該蛋白質(zhì)的基因序列，然后通過抗體、寡聚核苷酸探針或PCR制備的探針對(duì)文庫進(jìn)行篩選來分離目的基因。如植物抗病蟲基因工程中常用的蘇云金桿菌殺蟲晶體蛋白基因（Bt基因）、豇豆胰蛋白酶抑制基因（CpTI基因）、病毒外殼蛋白基因（CP基因）等。當(dāng)其他植物的同類基因已分離到并且核苷酸序列保守性較高時(shí)，也可直接用這些已知的基因片段作探針對(duì)未克隆到該基因的植物基因文庫進(jìn)行篩選，也可分離到未知的新基因。
2、通過遺傳表型分析
�。�1）基因標(biāo)鑒法。該法是利用轉(zhuǎn)座子或T-DNA插入植物的基因組中引起某一基因失活產(chǎn)生一些突變體，然后用相應(yīng)轉(zhuǎn)座子或T-DNA對(duì)突變體文庫進(jìn)行篩選，以選到的陽性克隆片段為探針，再篩選野生型植物因文庫分離目的基因。如將一株帶有功能的轉(zhuǎn)位因子系統(tǒng)的植物與另一株在遺傳上有差異的同種植物雜交，在雜交后代中篩選由于轉(zhuǎn)位因子插入到某一特定基因序列中導(dǎo)致表型破壞或改變的突變株，用該純合突變株構(gòu)建基因文庫，然后將轉(zhuǎn)位因子用同位素標(biāo)記作探針，從該文庫中篩選出帶有同源轉(zhuǎn)位因子的目的基因。該法主要限于二倍體的自花授粉作物如玉米、金魚草等。應(yīng)用該法已分離出與玉米種子發(fā)育有關(guān)的Viviparious-1基因及與金魚草花發(fā)育有關(guān)的一些基因等。
�。�2）激發(fā)子的寄主受體基因克隆技術(shù)。該技術(shù)是利用病菌無毒基因（avrgene）編氳募し⒆佑爰鬧骺共』?蟣嗦氳氖芴逯?浯嬖誆磺綴偷幕プ鞴叵擔(dān)?圓≡?し⒆擁鞍孜?咚鞣擲牒涂寺〕鲆恍┘付≈士共』?潁?綬?延胛薅凈?騛vr9對(duì)應(yīng)的抗病基因cf9，與avrPto對(duì)應(yīng)的抗病基因pto；擬南芥菜與avrRPS2對(duì)應(yīng)的抗病基因rpS2等。
3、以圖譜為基礎(chǔ)的定位克隆技術(shù)
以圖譜為基礎(chǔ)的定位克隆技術(shù)在分離未知產(chǎn)物的基因方面有廣闊的應(yīng)用前景。該法的基本前提是基因定位，然后以緊密連鎖的分子標(biāo)記如RFLP等為起點(diǎn)，通過染色體步移逐步向目標(biāo)基因靠近，最終克隆基因。其主要步驟包括：（1）將目標(biāo)基因定位在高密度的分子標(biāo)記連鎖群上；（2）利用PFGE將連銷標(biāo)記的遺傳圖譜距轉(zhuǎn)換成物理距離；（3）構(gòu)建YAC文庫，找到含連鎖標(biāo)記的YAC克隆，并通過克隆的排序獲得目標(biāo)基因的DNA片段；（4）通過轉(zhuǎn)化和功能互補(bǔ)試驗(yàn)證實(shí)基因所在的DNA片段。如用該技術(shù)已分離出番茄抗根結(jié)線蟲mi基因和擬南芥菜抗細(xì)菌性莖腐病的RPM1基因等。
這類技術(shù)主要通過生物化學(xué)和病理學(xué)研究分離鑒定有關(guān)基因的蛋白產(chǎn)物，并對(duì)蛋白質(zhì)氨基酸順序進(jìn)行分析，推斷出編碼該蛋白質(zhì)的基因序列，然后通過抗體、寡聚核苷酸探針或PCR制備的探針對(duì)文庫進(jìn)行篩選來分離目的基因。如植物抗病蟲基因工程中常用的蘇云金桿菌殺蟲晶體蛋白基因（Bt基因）、豇豆胰蛋白酶抑制基因（CpTI基因）、病毒外殼蛋白基因（CP基因）等。當(dāng)其他植物的同類基因已分離到并且核苷酸序列保守性較高時(shí)，也可直接用這些已知的基因片段作探針對(duì)未克隆到該基因的植物基因文庫進(jìn)行篩選，也可分離到未知的新基因。
2、通過遺傳表型分析
�。�1）基因標(biāo)鑒法。該法是利用轉(zhuǎn)座子或T-DNA插入植物的基因組中引起某一基因失活產(chǎn)生一些突變體，然后用相應(yīng)轉(zhuǎn)座子或T-DNA對(duì)突變體文庫進(jìn)行篩選，以選到的陽性克隆片段為探針，再篩選野生型植物因文庫分離目的基因。如將一株帶有功能的轉(zhuǎn)位因子系統(tǒng)的植物與另一株在遺傳上有差異的同種植物雜交，在雜交后代中篩選由于轉(zhuǎn)位因子插入到某一特定基因序列中導(dǎo)致表型破壞或改變的突變株，用該純合突變株構(gòu)建基因文庫，然后將轉(zhuǎn)位因子用同位素標(biāo)記作探針，從該文庫中篩選出帶有同源轉(zhuǎn)位因子的目的基因。該法主要限于二倍體的自花授粉作物如玉米、金魚草等。應(yīng)用該法已分離出與玉米種子發(fā)育有關(guān)的Viviparious-1基因及與金魚草花發(fā)育有關(guān)的一些基因等。
�。�2）激發(fā)子的寄主受體基因克隆技術(shù)。該技術(shù)是利用病菌無毒基因（avrgene）編氳募し⒆佑爰鬧骺共』?蟣嗦氳氖芴逯?浯嬖誆磺綴偷幕プ鞴叵擔(dān)?圓≡?し⒆擁鞍孜?咚鞣擲牒涂寺〕鲆恍┘付≈士共』?潁?綬?延胛薅凈?騛vr9對(duì)應(yīng)的抗病基因cf9，與avrPto對(duì)應(yīng)的抗病基因pto；擬南芥菜與avrRPS2對(duì)應(yīng)的抗病基因rpS2等。
3、以圖譜為基礎(chǔ)的定位克隆技術(shù)
以圖譜為基礎(chǔ)的定位克隆技術(shù)在分離未知產(chǎn)物的基因方面有廣闊的應(yīng)用前景。該法的基本前提是基因定位，然后以緊密連鎖的分子標(biāo)記如RFLP等為起點(diǎn)，通過染色體步移逐步向目標(biāo)基因靠近，最終克隆基因。其主要步驟包括：（1）將目標(biāo)基因定位在高密度的分子標(biāo)記連鎖群上；（2）利用PFGE將連銷標(biāo)記的遺傳圖譜距轉(zhuǎn)換成物理距離；（3）構(gòu)建YAC文庫，找到含連鎖標(biāo)記的YAC克隆，并通過克隆的排序獲得目標(biāo)基因的DNA片段；（4）通過轉(zhuǎn)化和功能互補(bǔ)試驗(yàn)證實(shí)基因所在的DNA片段。如用該技術(shù)已分離出番茄抗根結(jié)線蟲mi基因和擬南芥菜抗細(xì)菌性莖腐病的RPM1基因等。