良好的菌種是微生物發(fā)酵工業(yè)的基礎(chǔ)。在應(yīng)用微生物生產(chǎn)各類食品時，首先是選種的問題，要挑選出符合需要的菌種，一方面可以根據(jù)有關(guān)信息向菌種保藏機(jī)構(gòu)、工廠或科研單位直接索�。涣硪环矫娓鶕�(jù)所需菌種的形態(tài)、生理、生態(tài)和工藝特點(diǎn)的要求，從自然界特定的生態(tài)環(huán)境中以特定的方法分離出新菌株。其次是育種的工作，根據(jù)菌種的遺傳特點(diǎn)，改良菌株的生產(chǎn)性能，使產(chǎn)品產(chǎn)量、質(zhì)量不斷提高。第三當(dāng)菌種的性能下降時，還要設(shè)法使它復(fù)壯。最后還要有合適的工藝條件和合理先進(jìn)的設(shè)備與之配合，這樣菌種的優(yōu)良性能才能充分發(fā)揮。
4.1. 自然界工業(yè)菌種篩選程序
我國幅員遼闊，各地氣候條件、土質(zhì)條件、植被條件差異很大，這為自然界中各種微生物的存在提供了良好的生存環(huán)境。自然界中微生物種類繁多，估計不少于幾十萬種，但目前已為人類研究及應(yīng)用的不過千余種。由于微生物到處都有，無孔不入，所以它們在自然界大多是以混雜的形式群居于一起的。而現(xiàn)代發(fā)酵工業(yè)是以純種培養(yǎng)為基礎(chǔ)，故采用各種不同的篩選手段，挑選出性能良好、符合生產(chǎn)需要的純種是工業(yè)育種的關(guān)鍵一步。自然界工業(yè)菌種分離篩選的主要步驟是：采樣、增殖培養(yǎng)、培養(yǎng)分離和篩選。如果產(chǎn)物與食品制造有關(guān)，還需對菌種進(jìn)行毒性鑒定。
4.1.1. 采樣
以采集土壤為主。一般在有機(jī)質(zhì)較多的肥沃土壤中，微生物的數(shù)量最多，中性偏堿的土壤以細(xì)菌和放線菌為主，酸性紅土壤及森林土壤中霉菌較多，果園、菜園和野果生長區(qū)等富含碳水化合物的土壤和沼澤地中，酵母和霉菌較多。采樣的對象也可以是植物，腐敗物品，某些水域等。采樣應(yīng)充分考慮采樣的季節(jié)性和時間因素，以溫度適中，雨量不多的秋初為好。因?yàn)檎嬲脑鼐旱某霈F(xiàn)可能是短暫的，如在夏季或冬季土壤中微生物存活數(shù)量較少，暴雨后土壤中微生物會顯著減少。采樣方式是在選好適當(dāng)?shù)攸c(diǎn)后，用無菌刮鏟、土樣采集器等，采集有代表性的樣品，如特定的土樣類型和土層，葉子碎屑和腐質(zhì)，根系及根系周圍區(qū)域，海底水，泥及沉積物，植物表皮及各部，陰溝污水及污泥，反色動物第一胃內(nèi)含物，發(fā)酵食品等。
具體采集土樣時，就森林、旱地、草地而言，可先掘洞，由土壤下層向上層順序采集；就水田等浸水土壤而言，一般是在不損土層結(jié)構(gòu)的情況下插入圓筒采集。如果層次要求不嚴(yán)格，可取離地面5~15cm處的土。將采集到的土樣盛入清潔的聚乙烯袋、牛皮袋或玻璃瓶中。采好的樣必須完整地標(biāo)上樣本的種類及采集日期、地點(diǎn)以及采集地點(diǎn)的地理、生態(tài)參數(shù)等。采好的樣品應(yīng)及時處理，暫不能處理的也應(yīng)貯存于4℃下，但貯存時間不宜過長。這是因?yàn)橐坏┎蓸咏Y(jié)束，試樣中的微生物群體就脫離了原來的生態(tài)環(huán)境，其內(nèi)部生態(tài)環(huán)境就會發(fā)生變化，微生物群體之間就會出現(xiàn)消長。如果要分離嗜冷菌，則在室溫下保存試樣會使嗜冷菌數(shù)量明顯降低。
在采集植物根際土樣時，一般方法是將植物根從土壤中慢慢拔出，浸漬在大量無菌水中約20min，洗去粘附在根上的土壤，然后再用無菌水漂洗下根部殘留的土，這部分土即為根際土樣。
在采集水樣時，將水樣收集于100m1干凈、滅菌的廣口塑料瓶中。由于表層水中含有泥沙，應(yīng)從較深的靜水層中采集水樣。方法是：握住采樣瓶浸入水中30~50cm處，瓶口朝下打開瓶蓋，讓水樣進(jìn)入。如果有急流存在的話，應(yīng)直接將瓶口反向于急流。水樣采集完畢時，應(yīng)迅速從水中取出采集瓶并帶有較大的弧度。水樣不應(yīng)裝滿采樣瓶，采集的水樣應(yīng)在24h之內(nèi)迅速進(jìn)行檢測，或者4℃下貯存。
4.1.2. 增殖培養(yǎng)
一般情況下，采來的樣品可以直接進(jìn)行分離，但是如果樣品中我們所需要的菌類含量并不很多，而另一些微生物卻大量存在。此時，為了容易分離到所需要的菌種，讓無關(guān)的微生物至少是在數(shù)量上不要增加，即設(shè)法增加所要菌種的數(shù)量，以增加分離的幾率。可以通過選擇性的配制培養(yǎng)基（如營養(yǎng)成分、添加抑制劑等），選擇一定的培養(yǎng)條件（如培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基酸堿度等）來控制。具體方法是根據(jù)微生物利用碳源的特點(diǎn)，可選定糖、淀粉、纖維素，或者石油等，以其中的一種為唯一碳源，那么只有利用這一碳源的微生物才能大量正常生長，而其他微生物就可能死亡或淘汰。對G一菌有選擇的培養(yǎng)基(如結(jié)晶紫營養(yǎng)培養(yǎng)基、紅—紫膽汁瓊脂、煌綠膽汁瓊脂等)通常含有5%~10%的天然提取物。在分離細(xì)菌時，培養(yǎng)基中添加濃度一般為50μg／m1的抗真菌劑(如放線菌酮和制霉素)，可以抑制真菌的生長。在分離放線菌時，通常于培養(yǎng)基中加入1~5m1天然浸出汁(植物、巖石、有機(jī)混合腐質(zhì)等的浸出汁) 作為最初分離的促進(jìn)因子，由此可以分離出更多不同類型的放線菌類型；放線菌還可以十分有效地利用低濃度的底物和復(fù)雜底物(如幾丁質(zhì))，因此，大多數(shù)放線菌的分離培養(yǎng)是在貧脊或復(fù)雜底物的瓊脂平板上進(jìn)行的，而不是在含豐富營養(yǎng)的生長培養(yǎng)基上分離的；在放線菌分離瓊脂中通常加入抗真菌劑制霉菌素或放線菌酮，以抑制真菌的繁殖；此外，為了對某些特殊種類的放線菌進(jìn)行富集和分離，可選擇性地添加一些抗生素(如新生霉素)。在分離真菌時，利用低碳／氮比的培養(yǎng)基可使真菌生長菌落分散，利于計數(shù)、分離和簽定；在分離培養(yǎng)基中加入一定的抗生素如氯霉素、四環(huán)素、卡那霉素、青霉素、鏈霉素等即可有效地抑制細(xì)菌生長及其菌落形成；抑制細(xì)菌的另外一些方法有：在使用平皿之前，將平皿先干燥3~4天；降低培養(yǎng)基的pH值或在無法降低pH時，加入1：30000玫瑰紅。這樣有利于下階段的純種分離。
4.1.3. 培養(yǎng)分離
通過增殖培養(yǎng)，樣品中的微生物還是處于混雜生長狀態(tài)。因此還必須分離，純化。在這一步，增殖培養(yǎng)的選擇性控制條件還應(yīng)進(jìn)一步應(yīng)用，而且要控制得細(xì)一點(diǎn)，好一點(diǎn)。同時必須進(jìn)行純種分離，常用的分離方法有稀釋分離法、劃線分離法和組織分離法。稀釋分離法的基本方法是將樣品進(jìn)行適當(dāng)稀釋，然后將稀釋液涂布于培養(yǎng)基平板上進(jìn)行培養(yǎng)，待長出獨(dú)立的單個菌落，進(jìn)行挑選分離。劃線分離法要首先倒培養(yǎng)基平板，然后用接種針（接種環(huán)）挑取樣品，在平板上劃線。劃線方法可用分步劃線法或一次劃線法，無論用哪種方法，基本原則是確保培養(yǎng)出單個菌落。組織分離法主要用于食用菌菌種或某些植物病原菌的分離。分離時，首先用10%漂白粉或0.1%升汞液對植物或器官組織進(jìn)行表面消毒，用無菌水洗滌數(shù)次后，移植到培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基上，于適宜溫度培養(yǎng)數(shù)天后，可見微生物向組織塊周圍擴(kuò)展生長。經(jīng)菌落特征和細(xì)胞特征觀察確認(rèn)后，即可由菌落邊緣挑取部分菌種進(jìn)行移接斜面培養(yǎng)。
對于有些微生物如毛霉、根霉等在分離時，由于其菌絲的蔓延性，極易生長成片，很難挑取單菌落。常在培養(yǎng)基中添加0.1%的去氧膽酸鈉或在察氏培養(yǎng)基中添加0.1%的山梨糖及0.01%的蔗糖，利于單菌落的分離。
4.1.4. 篩選
經(jīng)過分離培養(yǎng)，在平板上出現(xiàn)很多單個菌落，通過菌落形態(tài)觀察，選出所需菌落，然后取菌落的一半進(jìn)行菌種鑒定，對于符合目的菌特性的菌落，可將之轉(zhuǎn)移到試管斜面純培養(yǎng)。這種從自然界中分離得到的純種稱為野生型菌株，它只是篩選的第一步，所得菌種是否具有生產(chǎn)上的實(shí)用價值，能否作為生產(chǎn)菌株，還必須采用與生產(chǎn)相近的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，通過三角瓶的容量進(jìn)行小型發(fā)酵試驗(yàn)，以求得適合于工業(yè)生產(chǎn)用菌種。這一步是采用與生產(chǎn)相近的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，通過三角瓶的容量進(jìn)行小型發(fā)酵試驗(yàn)，以求得適合于工業(yè)生產(chǎn)用菌種。如果此野生型菌株產(chǎn)量偏低，達(dá)不到工業(yè)生產(chǎn)的要求，可以留之作為菌種選育的出發(fā)菌株。
4.1.5. 毒性試驗(yàn)
自然界的一些微生物在一定條件下將產(chǎn)生毒素，為了保證食品的安全性，凡是與食品工業(yè)有關(guān)的菌種，除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草桿菌無須作毒性試驗(yàn)外，其他微生物均需通過兩年以上的毒性試驗(yàn)。
4.2. 微生物的誘變育種
從自然界直接分離的菌種，一般而言其發(fā)酵活力往往是比較低的，不能達(dá)到工業(yè)生產(chǎn)的要求，因此要根據(jù)菌種的形態(tài)、生理上的特點(diǎn)，改良菌種。以微生物的自然變異為基礎(chǔ)的生產(chǎn)選種的幾率并不高，因?yàn)檫@種變異率太小，僅為10—6~10—10。為了加大其變異率，采用物理和化學(xué)因素促進(jìn)其誘發(fā)突變，這種以誘發(fā)突變?yōu)榛A(chǔ)的育種就是誘變育種，它是國內(nèi)外提高菌種產(chǎn)量、性能的主要手段。 誘變育種具有極其重要的意義，當(dāng)今發(fā)酵工業(yè)所使用的高產(chǎn)菌株，幾乎都是通過誘變育種而大大提高了生產(chǎn)性能。誘變育種不僅能提高菌種的生產(chǎn)性能而且能改進(jìn)產(chǎn)品的質(zhì)量、擴(kuò)大品種和簡化生產(chǎn)工藝等。從方法上講，它具有方法簡便、工作速度快和效果顯著等優(yōu)點(diǎn)。因此，雖然目前在育種方法上，雜交、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)以及基因工程、原生質(zhì)體融合等方面的研究都在快速地發(fā)展，但誘變育種仍為目前比較主要、廣泛使用的育種手段。
4.2.1. 誘變育種的步驟和方法
誘變育種的步驟如下（圖5－18）：
圖5－18. 誘變育種的步驟
出發(fā)菌株的選擇 用來進(jìn)行誘變或基因重組育種處理的起始菌株稱為出發(fā)菌株。在誘變育種中，出發(fā)菌株的選擇，會直接影響到最后的誘變效果，因此必須對出發(fā)菌株的產(chǎn)量、形態(tài)、生理等方面有相當(dāng)?shù)牧私�，挑選出對誘變劑敏感性大、變異幅度廣、產(chǎn)量高的出發(fā)菌株。具體方法是選取自然界新分離的野生型菌株，它們對誘變因素敏感，容易發(fā)生變異；選取生產(chǎn)中由于自發(fā)突變或長期在生產(chǎn)條件下馴化而篩選得到的菌株，與野生型菌株較相象，容易達(dá)到較好的誘變效果；選取每次誘變處理都有一定提高的菌株，往往多次誘變可能效果迭加，積累更多的提高。另外，出發(fā)菌株還可以同時選取2~3株，在處理比較后，將更適合的菌株留著繼續(xù)誘變。
另外，對于基因重組的出發(fā)菌株，無論是供體還是受體，都必須考慮與重組方式對應(yīng)的基本性能，如感受態(tài)、性親和性、噬菌體吸附位點(diǎn)等，還必須考慮標(biāo)記互補(bǔ)、選擇性性狀、受菌體的強(qiáng)代謝活性、營養(yǎng)需求、生長速度等，以及與社會公害有關(guān)的問題如耐藥性、致病性、腸道寄生性等。
同步培養(yǎng) 在誘變育種中，處理材料一般采用生理狀態(tài)一致的單倍體、單核細(xì)胞，即菌懸液的細(xì)胞應(yīng)盡可能達(dá)到同步生長狀態(tài)，這稱為同步培養(yǎng)。細(xì)菌一般要求培養(yǎng)至對數(shù)生長期，此時群體生長狀態(tài)比較同步，比較容易變異，重復(fù)性較好。如亞硝基胍誘變時作用于復(fù)制叉處，生長旺盛的細(xì)胞中復(fù)制叉點(diǎn)較多，堿基類似物也在此時期比較容易進(jìn)入DNA鏈中。霉菌處理使用分生孢子，應(yīng)該將分生孢子在液體培養(yǎng)基中短時間培養(yǎng)，使孢子孵化，處于活化狀態(tài)，并恰好未形成菌絲體，易于誘變。
單細(xì)胞(或單孢子) 懸液的制備 這一步的關(guān)鍵是制備一定濃度的分散均勻的單細(xì)胞或單孢子懸液，為此要進(jìn)行細(xì)胞的培養(yǎng)，并收集菌體、過濾或離心、洗滌。菌懸液一般可用生理鹽水或緩沖溶液配制，如果是用化學(xué)誘變劑處理，因處理時 pH值會變化，必須要用緩沖溶液。除此之外，還應(yīng)注意分散度，方法是先用玻璃珠振蕩分散，再用脫脂棉或?yàn)V紙過濾，經(jīng)處理，分散度可達(dá)90％以上，這樣，可以保證菌懸液均勻地接觸誘變劑 ，獲得較好誘變效果。最后制得的菌懸液，霉菌孢子或酵母菌細(xì)胞的濃度大約為106~107個／ml，放線菌和細(xì)菌的濃度大約為108個／ml。菌懸液的細(xì)胞可用平板計數(shù)法、血球計數(shù)板或光密度法測定，但以平板計數(shù)法較為準(zhǔn)確。
誘變處理 首先選擇合適的誘變劑，然后確定其使用劑量。常用誘變劑有兩大類：物理誘變劑和化學(xué)誘變劑。 常用的物理誘變劑有紫外線、x射線、γ射線(如Co60等)、等離子、快中子、α射線、β射線、超聲波等。常用的化學(xué)誘變劑有堿基類似物、烷化劑、羥胺、吖定類化合物等。
物理誘變劑中最常用的有紫外線。由于紫外線不需要特殊貴重設(shè)備，只要普通的滅菌紫外燈管即能做到，而且誘變效果也很顯著，因此被廣泛應(yīng)用于工業(yè)育種。紫外線是波長短于紫色可見光而又緊接紫色光的射線、波長范圍為136～300nm，紫外線波長范圍雖寬，但有效范圍僅限于一個小區(qū)域，多種微生物最敏感的波長集中在265nm處，對應(yīng)于功率為15W的紫外燈。它是一種非電離輻射，當(dāng)物質(zhì)吸收一定能量的紫外線后，它的某些電子將被提升到較高的能量水平，從而引起分子激發(fā)而造成突變；而不吸收紫外線的物質(zhì)，能量不發(fā)生轉(zhuǎn)移，分子也不會激發(fā)，不會產(chǎn)生任何化學(xué)變化，然而，脫氧核糖核酸能大量吸收紫外線，因此它極容易受紫外線的影響而變化。紫外線的誘變作用是由于它引起DNA分子結(jié)構(gòu)變化而造成的。這種變化包括DNA鏈的斷裂，DNA分子內(nèi)和分子間的交連，核酸與蛋白質(zhì)的交聯(lián)，嘧啶水合物和嘧啶二聚體的產(chǎn)生等，特別是嘧啶二聚體的產(chǎn)生對于DNA的變化起主要作用。
紫外誘變的方法是：將10m1菌懸液放在直徑為9cm的培養(yǎng)皿中，液層厚度約為2mm，啟動磁力攪拌器，使用15w功率紫外燈管，照射距離為30cm左右，照射時間以幾秒至數(shù)十分鐘為宜，具芽孢的菌株需處理10 min左右。為準(zhǔn)確起見，照射前紫外燈應(yīng)先預(yù)熱20~30min，然后再進(jìn)行處理。不同的微生物對于紫外線的敏感程度不一樣，因此不同的微生物對于誘變所需要的劑量也不同。在紫外燈的功率、照射距離已定的情況下，決定照射劑量的只有照射時間，這樣可以設(shè)計一個照射不同時間梯度的實(shí)驗(yàn)，根據(jù)不同時間照射的死亡率，作出照射時間與死亡率的曲線，這樣就可以選擇適當(dāng)?shù)恼丈鋭┝俊Ｒ话阋哉丈浜笪⑸锏闹滤缆试?0%~99.9% 的劑量為最佳照射劑量，近來也有傾向于采用殺菌率70%~75%甚至更低(30%~70%)的劑量。一般認(rèn)為，偏低的劑量處理后正突變率較高，而用較高的劑量時則負(fù)突變率較高，但高劑量造成損傷大、回復(fù)少。目前趨向采用低劑量、長時間處理，盡管致死率較高，而誘變效果較好。實(shí)驗(yàn)時，為了避免光復(fù)活現(xiàn)象，處理過程應(yīng)在暗室的紅光下操作，處理完畢后，將盛菌懸液的器皿用黑布包起來培養(yǎng)，然后再進(jìn)行分離篩選。
CO60屬γ射線，是一種高能電磁波，其誘發(fā)的突變率和射線劑量直接有關(guān)，而與時間長短無關(guān)。它能產(chǎn)生電離作用，直接和間接改變DNA結(jié)構(gòu)。直接的效應(yīng)是導(dǎo)致堿基的化學(xué)鍵、脫氧核糖的化學(xué)鍵、糖-磷酸相連接的化學(xué)鍵的斷裂；間接的效應(yīng)是電離輻射使水和有機(jī)分子產(chǎn)生自由基，自由基作用于DNA分子，特別是對嘧啶的作用更強(qiáng)，可引起缺失和損傷，造成基因突變，還能引起染色體斷裂，引起倒位、缺失和易位等畸變。不同的微生物對C060的輻射敏感程度差異很大，可以相差幾倍，引起最高變異的劑量也隨菌種而有所不同。一般照射時多采用菌懸液，也可用長了菌落的平皿直接照射。照射劑量在4~10萬倫琴，或者采用能使微生物產(chǎn)生90％~99％死亡率的劑量。電離幅射是造成染色體巨大損傷的最好誘變劑，它能造成不可回復(fù)的缺失突變，但可能影響鄰近基因的性能。
等離子輸入是一種較新的誘變方法，國外自20世紀(jì)60年代中、后期相繼開始把等離子注入技術(shù)應(yīng)用于生物學(xué)領(lǐng)域的研究，國內(nèi)將離子束作為一種新技術(shù)應(yīng)用于生物等品種改良的研究則是由中國科學(xué)院等離子體物理研究所于1986年開創(chuàng)的。低能離子束是以具質(zhì)量、能量雙重誘變效應(yīng)的特征不同于傳統(tǒng)的電磁輻射，它的注入引發(fā)的生物效應(yīng)，機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜，既有能量的沉積、動量的傳遞，又有粒子的注入和電荷的交換，可導(dǎo)致細(xì)胞表面被刻蝕，引起細(xì)胞膜透性和膜電場的改良，與γ射線，中子束等明顯不同。離子束與生物體作用，首先有能量的沉積，即注入離子與生物大分子發(fā)生一系列碰撞，生物大分子獲得能量時，鍵斷裂，分子擊出原位，留下斷鍵或缺陷；同時還有質(zhì)量沉積，離子束是高LET粒子，有Braag峰，具有較強(qiáng)的電離作用，還能產(chǎn)生活性高的自由基間接損傷作用，因此它對生物體的作用可導(dǎo)致較高的突變率；另外由于注入離子的不同電荷數(shù)、質(zhì)量數(shù)、能量、劑量的組合，提供了眾多的誘變條件，通過這種電、能、質(zhì)的聯(lián)合作用，將強(qiáng)烈影響生物細(xì)胞的生理生化特性，以引起基因突變，所以變異幅度大，有較高的突變率，較廣的突變譜；再者突變體的遺傳性能比較穩(wěn)定，回復(fù)突變率低。
化學(xué)誘變劑 化學(xué)誘變劑的種類很多，根據(jù)它們對DNA的作用機(jī)制，可以分為三大類：第一類是烷化劑，它與一個或多個核酸堿基起化學(xué)變化，因而引起DNA復(fù)制時堿基配對的轉(zhuǎn)換而發(fā)生變異。例如硫酸二乙酯、亞硝酸、甲基磺酸乙酯、N-甲基-N’-亞硝基胍、亞硝基甲基尿等。第二類是一些堿基類似物，它們通過代謝作用滲入到DNA分子中而引起變異，例如 5-溴尿嘧啶、5-氨基尿嘌呤、2-氨基嘌呤、8-氮鳥嘌呤等。第三類是吖啶類，它造成DNA分子增加或減少一、二個堿基，從而引起堿基突變點(diǎn)以下全部遺傳密碼在轉(zhuǎn)錄和翻譯時產(chǎn)生錯誤。選擇化學(xué)誘變劑時還應(yīng)注意：亞硝胺和烷化劑應(yīng)用的范圍較廣，造成的遺傳損傷較多，其中亞硝基胍和甲基磺酸乙酯被稱為“超誘變劑”， 甲基磺酸乙酯是毒性最小的誘變劑之一。堿基類似物和羥胺雖然具有很高的特異性，但很少使用，因其回復(fù)突變率高，效果不大。
決定化學(xué)誘變劑劑量的因素主要有誘變劑的濃度、作用溫度和作用時間�；瘜W(xué)誘變劑的處理濃度常用幾微克~幾毫克／毫升，但是這個濃度取決于藥劑、溶劑及微生物本身的特性，還受水解產(chǎn)物的濃度、一些金屬離子以及某些情況下誘變劑的延遲作用的影響。一般對于一種化學(xué)誘變劑，處理濃度對不同微生物有一個大致范圍，在進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)時，也通常是將處理濃度、處理溫度確定后，測定不同時間的致死率來確定適宜的誘變劑量。這里需要說明的是化學(xué)誘變劑與物理誘變劑不同，在處理到確定時間后，要有合適的終止反應(yīng)方法，一般采用稀釋法、解毒劑或改變pH值等方法來終止反應(yīng)。
要確定一個合適的劑量，通常要經(jīng)過多次試驗(yàn)，就一般微生物而言，誘變頻率往往隨劑量的增高而增高，但達(dá)到一定劑量后，再提高劑量會使誘變頻率下降。根據(jù)對紫外線、x 射線及乙烯亞胺等誘變劑誘變效應(yīng)的研究，發(fā)現(xiàn)正突變較多地出現(xiàn)在較低的劑量中。而負(fù)突變則較多地出現(xiàn)在高劑量中，同時還發(fā)現(xiàn)經(jīng)多次誘變而提高產(chǎn)量的菌株中，高劑量更容易出現(xiàn)負(fù)突變。因此，在誘變育種工作中，目前較傾向于采用較低劑量。
在誘變育種時，有時可根據(jù)實(shí)際情況，采用多種誘變劑復(fù)合處理的辦法。復(fù)合處理方法主要有三類：第一類是兩種或多種誘變劑先后使用；第二類是同一種誘變劑的重復(fù)使用；第三類是兩種或多種誘變劑的同時使用。如果能使用不同作用機(jī)制的誘變劑來做復(fù)合處理，可能會取得更好的誘變效果。誘變劑的復(fù)合處理常呈現(xiàn)一定的協(xié)同效應(yīng)，這對誘變育種的工作是很有價值的。
中間培養(yǎng) 對于剛經(jīng)誘變劑處理過的菌株，有一個表現(xiàn)遲滯的過程，即細(xì)胞內(nèi)原酶有量的稀釋過程（生理延遲），需3代以上的繁殖才能將突變性狀表現(xiàn)出來。據(jù)此應(yīng)讓變異處理后細(xì)胞在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)幾小時，使細(xì)胞的遺傳物質(zhì)復(fù)制，繁殖幾代，以得到純的變異細(xì)胞。這樣，穩(wěn)定的變異就會顯現(xiàn)出來。若不經(jīng)液體培養(yǎng)基的中間培養(yǎng)，直接在平皿上分離就會出現(xiàn)變異和不變異細(xì)胞同時存在于一個菌落內(nèi)的可能，形成混雜菌落，以致造成篩選結(jié)果的不穩(wěn)定和將來的菌株退化。
分離和篩選 經(jīng)過中間培養(yǎng)，分離出大量的較純的單個菌落，接著，要從幾千萬個菌落中篩選出幾個好的，即篩選出所謂性能良好的正突變菌株，這將要花費(fèi)大量的人力和物力。怎樣設(shè)計才能花費(fèi)較少的工作量達(dá)到最好的效果，這是篩選工作中的一條原則。一般采用一些方法加以簡化，如利用形態(tài)突變直接淘汰低產(chǎn)變異菌株，或利用平皿反應(yīng)直接挑取高產(chǎn)變異菌株等。平皿反應(yīng)是指每個變異菌落產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物與培養(yǎng)基內(nèi)的指示物在培養(yǎng)基平板上作用后表現(xiàn)出一定的生理效應(yīng)，如變色圈、透明圈、生長圈、抑菌圈等，這些效應(yīng)的大小表示變異菌株生產(chǎn)活力的高低，以此作為篩選的標(biāo)志。常用的方法有紙片培養(yǎng)顯色法、透明圈法、瓊脂塊培養(yǎng)法等。
4.2.2. 營養(yǎng)缺陷型突變體的篩選及應(yīng)用
在誘變育種工作中，營養(yǎng)缺陷型突變體的篩選及應(yīng)用有著十分重要的意義。營養(yǎng)缺陷型菌株是指通過誘變而產(chǎn)生的缺乏合成某些營養(yǎng)物質(zhì)(如氨基酸、維生素、嘌呤和嘧啶堿基等)的能力，必須在其基本培養(yǎng)基中加入相應(yīng)缺陷的營養(yǎng)物質(zhì)才能正常生長繁殖的變異菌株。其變異前的菌株稱為野生菌株。凡是能滿足野生菌株正常生長的最低成分的合成培養(yǎng)基，稱為基本培養(yǎng)(MM)；在基本培養(yǎng)基中加入一些富含氨基酸、維生素及含氮堿基之類的天然有機(jī)物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、酵母膏等，能滿足各種營養(yǎng)缺陷型菌株生長繁殖的培養(yǎng)基，稱為完全培養(yǎng)基(CM)；在基本培養(yǎng)基中只是有針對性的加入某一種或某幾種自身不能合成的有機(jī)營養(yǎng)成分，以滿足相應(yīng)的營養(yǎng)缺陷型菌株生長的培養(yǎng)基，稱為補(bǔ)充培養(yǎng)基(SM)。
營養(yǎng)缺陷型菌株的篩選一般要經(jīng)過誘變、淘汰野生型菌株、檢出缺陷型和確定生長譜四個環(huán)節(jié)。誘變劑處理時與其它誘變處理基本相同。在誘變處理后的存活個體中，營養(yǎng)缺陷型的比例一般很低，通常只有百分之幾至千分之幾，采用抗菌素法或菌絲過濾法，可以淘汰為數(shù)眾多的野生型菌株，從而達(dá)到濃縮營養(yǎng)缺陷型的目的�？股胤ㄊ抢靡吧途昴茉贛M中生長，而缺陷型不能生長，于是將誘變處理液在MM中培養(yǎng)短時讓野生型生長，處于活化階段，而缺陷型無法生長，仍處于“休眠狀態(tài)”，這時，加入一定量的抗生素，結(jié)果活化狀態(tài)的野生型就被殺死，保存了缺陷型。在選擇抗生素時，細(xì)菌可以用青霉素，酵母可用制霉菌素。 菌絲過濾法只適用于絲狀真菌，其原理是在基本培養(yǎng)基中，野生型的孢子能發(fā)芽成菌絲，而營養(yǎng)缺陷型則不能。因此將誘變處理后的孢子在基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時間后，再進(jìn)行過濾。如此重復(fù)數(shù)次后，就可以除去大部分野生型菌株，同樣達(dá)到“濃縮”營養(yǎng)缺陷型的目的。
營養(yǎng)缺陷型的檢出方法很多，主要有影印法、夾層法、逐個檢出法、限量補(bǔ)充培養(yǎng)法等四種。影印法是將誘變處理后的細(xì)胞涂布在完全培養(yǎng)基表面上，經(jīng)培養(yǎng)后長出菌落，然后用一小塊直徑比平皿稍小的圓柱形木塊復(fù)蓋于滅過菌的絲絨布上作為接種工具，將長出菌落的平皿倒轉(zhuǎn)過來，在絲絨上輕輕按一下，轉(zhuǎn)接到另一基本培養(yǎng)基平板上，經(jīng)培養(yǎng)后，比較這兩個平皿長出的菌落。如果發(fā)現(xiàn)前一平扳上某一部位長有菌落，而在后一培養(yǎng)基上的相應(yīng)部位卻沒有，就說明這是一個營養(yǎng)缺陷型菌落。夾層培養(yǎng)法是先在培養(yǎng)皿上倒一層基本培養(yǎng)基，冷凝后加上一層含菌液的基本培養(yǎng)基，凝固后再澆上一薄層的基本培養(yǎng)基。經(jīng)培養(yǎng)后，在皿底對首先出現(xiàn)的菌落做標(biāo)記，然后再倒上一薄層完全培養(yǎng)基(或補(bǔ)充培養(yǎng)基)，再培養(yǎng)，這時再出現(xiàn)的新菌落，多數(shù)即為營養(yǎng)缺陷型。此法缺點(diǎn)是，結(jié)果有時不明確，而且將缺陷型菌落從夾層中挑出并不很容易。逐個檢出法是將經(jīng)過誘變處理的細(xì)胞涂布在完全培養(yǎng)基平板上，待長出單個菌落后，用接種針或牙簽將這些單個菌落逐個依次地分別接種到基本培養(yǎng)基和另一完全培養(yǎng)基平板上。經(jīng)培養(yǎng)后，如果在完全培養(yǎng)基上長出菌落，而在基本培養(yǎng)基上卻不長菌落，說明這是一個營養(yǎng)缺陷型菌株。限量補(bǔ)充培養(yǎng)法是將誘變處理后的細(xì)胞接種在含有微量(0.01％以下)蛋白胨的基本培養(yǎng)基上。野生型菌株就會迅速生長成較大的菌落，而營養(yǎng)缺陷型菌株只能形成生長緩慢的微小菌落，因而可以識別檢出。如果想得到某一特定缺陷型菌株，則可直接在基本培養(yǎng)基上加入微量的相應(yīng)物質(zhì)。
確定生長譜是指采用上法選出的缺陷型菌株經(jīng)幾次驗(yàn)證確定后，還需確定其缺陷的因子，是氨基酸缺陷型，還是維生素缺陷型，或是嘌呤、嘧啶缺陷型。生長譜測定可以用兩種方法：一種是將缺陷型菌株培養(yǎng)后，收集菌體，洗滌培養(yǎng)基，制備成細(xì)胞懸液后，與MM培養(yǎng)基（融化并涼至50°C）混合并傾注平皿。待凝固后，分別在平皿的5~6個區(qū)間放上不同的營養(yǎng)組合的混合物或吸飽此組織營養(yǎng)物的濾紙圓片，培養(yǎng)后會在組合區(qū)長出，就可測得所需營養(yǎng)。另一種方法是以不同組合的營養(yǎng)混合物與融化涼至50°C的MM培養(yǎng)基鋪成平皿，然后在這些平皿上劃線接種各個缺陷型菌株于相應(yīng)位置，培養(yǎng)后根據(jù)在什么組合長出可推知其營養(yǎng)因子。
營養(yǎng)缺陷型菌株不論在科學(xué)實(shí)驗(yàn)中，還是在生產(chǎn)實(shí)踐中都具有廣泛的用途。利用營養(yǎng)缺陷型菌株定量分析各種生長因素的方法稱為微生物分析法。常用于分析食品中氨基酸和維生素的含量，因?yàn)樵谝欢舛确秶鷥?nèi)，營養(yǎng)缺陷型菌株生長繁殖的數(shù)量與其所需維生素和氨基酸的量成正比。這種方法特異性強(qiáng)，靈敏度高，所用樣品可以很少而且不需提純，也不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備。 利用營養(yǎng)缺陷型菌株作為研究轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合等遺傳規(guī)律的標(biāo)記菌種和微生物雜交育種的標(biāo)記。由于微生物經(jīng)雜交育種后形成的雜種在形態(tài)上往往與親本難以區(qū)別，因此常常選擇不同的營養(yǎng)缺陷型來進(jìn)行標(biāo)記，通過測定后代的營養(yǎng)特性，以判斷它們雜交的性質(zhì)。利用營養(yǎng)缺陷型菌株測定微生物的代謝途徑，并通過有意識地控制代謝途徑，獲得更多的我們所需要的代謝產(chǎn)物，從而成為發(fā)酵生產(chǎn)氨基酸、核苷酸和各種維生素等的生產(chǎn)菌種，例如利用絲氨酸營養(yǎng)缺陷型可以生產(chǎn)更多的賴氨酸，利用腺苷酸營養(yǎng)缺陷型菌株可提高肌苷酸的產(chǎn)量等。
4.3. 微生物的雜交育種
雜交育種是指將兩個基因型不同的菌株經(jīng)細(xì)胞的互相聯(lián)結(jié)、細(xì)胞核融合，隨后細(xì)胞核進(jìn)行減數(shù)分裂，遺傳性狀會出現(xiàn)分離和重新組合的現(xiàn)象，產(chǎn)生具有各種新性狀的重組體，然后經(jīng)分離和篩選，獲得符合要求的生產(chǎn)菌株。盡管一些優(yōu)良菌種的選育主要是采用誘變育種的方法，但是某一菌株長期使用誘變劑處理后，其生活能力一般要逐漸下降，如生長周期延長、孢子量減少、代謝減慢、產(chǎn)量增加緩慢、誘變因素對產(chǎn)量基因影響的有效性降低等。因此，常采用雜交育種的方法繼續(xù)優(yōu)化菌株。另外，由于雜交育種是選用已知性狀的供體和受體菌種作為親本，因此不論在方向性還是自覺性方面，都比誘變育種前進(jìn)了一大步，所以它是微生物菌種選育的另一重要途徑。但由于雜交育種的方法復(fù)雜，工作進(jìn)度慢，因此還很難象誘變育種那樣得到普遍的推廣和應(yīng)用。
4.3.1. 細(xì)菌的雜交
細(xì)菌的雜交行為是于1946年首次在大腸桿菌K-12菌株中發(fā)現(xiàn)并證實(shí)的。首先在大腸桿菌K-12菌株中誘發(fā)一個營養(yǎng)缺陷型(A—)、不能發(fā)酵乳糖(Lac—)和抗鏈霉素(SM r )以及對噬菌體T l敏感的突變體，可以寫成A—B +Lac—SM r T s1；另一菌株誘發(fā)成一個營養(yǎng)缺陷型(B—)，能發(fā)酵乳糖(Lac+)，對鏈霉菌敏感(SM s)和抗噬菌體T l的突變體A+B—Lac +SM s T r 1。這兩個菌株各自都不能在基本培養(yǎng)基上生長，如果把大約105 /ml濃度的上述兩種菌株混合在一起，并接種在基本培養(yǎng)基上，則能長出少數(shù)菌落；如果把上述兩種菌株分別接種到一個特制的U型管的兩端去培養(yǎng),中間用一片可以使培養(yǎng)液流通,但不能使細(xì)菌通過的燒結(jié)玻璃隔開,那么在基本培養(yǎng)基上就不會出現(xiàn)菌落。這說明細(xì)胞的接觸是導(dǎo)致基因重組的必要條件，即細(xì)菌通過接合完成了雜交行為。在鼠傷寒沙門氏菌、綠膿桿菌、肺炎克氏桿菌、霍亂弧菌等許多細(xì)菌中也發(fā)現(xiàn)了沒接合現(xiàn)象，但是至今未在革蘭氏陽性菌中發(fā)現(xiàn)接合現(xiàn)象。細(xì)菌的雜交還可以通過F因子轉(zhuǎn)移,轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)等發(fā)生基因重組,但通過這些方式進(jìn)行雜交育種獲得成功的報道還不多。
4.3.2. 放線菌的雜交育種
放線菌的基因重組于1955年至1957年首先在天藍(lán)鏈霉菌中發(fā)現(xiàn),以后在其它科、屬、種中相繼發(fā)現(xiàn)�，F(xiàn)在常用的放線菌雜交方法主要有三種,即混合培養(yǎng)法、平板雜交法和玻璃紙轉(zhuǎn)移法。國外在金霉素、土霉素、新生霉素等抗生素產(chǎn)生菌的雜交育種方面都有過成功的報道,在我國幾乎與國外同時起步開展放線菌基因重組的研究工作,并取得了一定成效。
4.3.3. 酵母的雜交育種
一般而言，雜交育種運(yùn)用了酵母的單雙倍生活周期，將不同基因型和相對的交配型的單倍體細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)雜交而形成二倍體細(xì)胞，經(jīng)篩選便可獲得新的遺傳性狀。酵母的雜交方法有孢子雜交法，群體交配法，單倍體細(xì)胞雜交法和罕見交配法。就啤酒酵母而言，運(yùn)用罕見交配法更易獲得結(jié)果。
4.3.4. 霉菌的雜交育種
霉菌的雜交育種主要是通過體細(xì)胞的核融合和基因重組，即通過準(zhǔn)性生殖過程而不是通過性細(xì)胞的融合。
霉菌的雜交育種的步驟為：第一 選擇直接親本。用來進(jìn)行雜交的兩個野生型菌株叫原始親本。原始親本經(jīng)過誘變以后得到各種突變型菌株,假設(shè)這種菌株是用來作為形成異核體的親本,就叫直接親本。作為直接親本的遺傳標(biāo)記有多種，如營養(yǎng)突變型、抗藥突變型、形態(tài)突變型等,目前應(yīng)用普遍的是營養(yǎng)缺陷型菌株。第二是異核體的形成。在基本培養(yǎng)基上,強(qiáng)迫兩株?duì)I養(yǎng)缺陷型互補(bǔ)營養(yǎng)，則這兩個菌株經(jīng)過菌絲細(xì)胞間的吻合形成異核體。由直接親本形成異核體的方法有：完全培養(yǎng)基液體混合培養(yǎng)法、完全培養(yǎng)基斜面混合培養(yǎng)法、液體有限培養(yǎng)基混合培養(yǎng)法、有限培養(yǎng)基平板異核叢形成法、基本培養(yǎng)基斜面銜接接種法、基本培養(yǎng)基平板穿刺法等。第三是雙倍體的檢出，檢出雙倍體的方法有很多種，如用放大鏡觀察異核體菌落表面，如果發(fā)現(xiàn)有野生型顏色的斑點(diǎn)和扇面，即可用接種針將其孢子挑出，進(jìn)行分離純化，即得雜合雙倍體�；蛘邔⒋罅慨惡梭w孢子分離于基本培養(yǎng)基平板上從中長出野生型原養(yǎng)性菌落，將其挑出分離純化，即得雜合雙倍體。第四是分離子的檢出�？梢杂眠x擇性培養(yǎng)基篩選分離子，也可以將雜合雙倍體單孢子分離于完全培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)至菌落成熟，檢查大量雙倍體菌落，在一些菌落上有突變顏色（隱性標(biāo)記）的斑點(diǎn)或扇面出現(xiàn)，從每個菌落接出一個斑點(diǎn)或扇面的孢子于完全培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)后經(jīng)過純化和鑒別即得分離子。
4.4. 原生質(zhì)體育種
原生質(zhì)體育種技術(shù)主要有原生質(zhì)體融合、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，原生質(zhì)體誘變育種等。原生質(zhì)體融合育種是基因重組的一種重要方法，由于它具有一系列的特點(diǎn)，所以目前已為國內(nèi)外微生物育種學(xué)者所廣泛研究和應(yīng)用。
由于細(xì)胞壁是微生物細(xì)胞之間進(jìn)行物質(zhì)交換的主要障礙之一，用一些方法將細(xì)胞壁去除后在高滲條件下形成類似球形的原生質(zhì)體，在原生質(zhì)體融合時又加入融合促進(jìn)劑聚乙二醇（PEG）和Ca++，所以微生物原生質(zhì)體間的雜交頻率都明顯高于常規(guī)雜交法，霉菌與放線菌已達(dá)10—l ~10—2，細(xì)菌與酵母已達(dá)10-5~10-6。原生質(zhì)體融合受接合型或致育型的限制較小，二親株中任何一株都可能起受體或供體的作用，因此有利于不同種屬間微生物的雜交。已報道的絲狀真菌種間的原生質(zhì)體融合主要是曲霉屬和青霉屬；屬間原生質(zhì)體融合主要在酵母中實(shí)現(xiàn)：熱帶假絲酸母×飾針復(fù)膜孢酵母，釀酒酵母×彭貝裂殖酵母等。原生質(zhì)體融合是二親株的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核進(jìn)行類似的合二為一的過程，因此可以想象遺傳物質(zhì)的交換更為完整，提高菌株產(chǎn)量的潛力更大。原生質(zhì)體融合可以是兩株以上的親株同時參與融合，如研究表明兩個親株的融合頻率為2.8×10-2，三個親株的融合頻率為4×10-4，四個親株的融合頻率為4.9×10-7。
原生質(zhì)體融合育種的步驟是：標(biāo)記菌株的篩選和穩(wěn)定性驗(yàn)證 ，原生質(zhì)體制備，等量原生質(zhì)體加聚乙二醇促進(jìn)融合，涂布于再生培養(yǎng)基、再生出菌落，選擇性培養(yǎng)基上劃線生長、分離驗(yàn)證、挑取融合子進(jìn)一步試驗(yàn)保藏，生產(chǎn)性能篩選。
前面已經(jīng)提到轉(zhuǎn)化在工業(yè)微生物遺傳改良及基因工程中占有十分重要的地位。但除少數(shù)細(xì)菌外，多數(shù)微生物的自然轉(zhuǎn)化能力很低，特別是真核微生物幾乎很少能發(fā)現(xiàn)自然轉(zhuǎn)化。這主要是因?yàn)檗D(zhuǎn)化的必備條件之一是感受態(tài)的存在，經(jīng)過人工誘導(dǎo)法可使一些微生物獲得感受態(tài)，已成功的例子如枯草芽抱桿菌、大腸桿菌等并得到廣泛應(yīng)用。但在鏈霉菌及真菌中，人工誘導(dǎo)法實(shí)現(xiàn)完整細(xì)胞的轉(zhuǎn)化的成功例子就不多了。原生質(zhì)體技術(shù)出現(xiàn)后不久，Bibb等發(fā)現(xiàn)，當(dāng)有PEG存在時，質(zhì)粒DNA可以很高頻率轉(zhuǎn)化鏈霉菌原生質(zhì)體，從而徹底擺脫了轉(zhuǎn)化依賴感受態(tài)出現(xiàn)的限制。在真菌中巳成功地進(jìn)行原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的菌株如釀酒酵母、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉、米曲霉等。
圖5－19. 基因工程技術(shù)的主要操作步驟示意圖
4.5. 基因工程技術(shù)用于工業(yè)菌種改良
基因工程技術(shù)又稱基因操作、基因克隆、DNA重組等，是一個將含目的基因DNA片段經(jīng)體外操作與載體連接，轉(zhuǎn)入一個受體細(xì)胞并使之?dāng)U增、表達(dá)的過程。因此比其它育種方法更有目的性和方向性，效率更高。其全部過程大體可分為以下6個步驟（如圖5－19）：目的基因的獲得；載體的選擇；含目的基因的DNA片段克隆入載體中構(gòu)成重組載體；將重組載體引入宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制、擴(kuò)增；篩選出帶有重組目的基因的轉(zhuǎn)化細(xì)胞；鑒定外源基因的表達(dá)產(chǎn)物。
目的基因的獲得 目的基因的獲得一般有四條途徑；從生物細(xì)胞中提取、純化染色體DNA并經(jīng)適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶部分酶切；經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶的作用由mRNA在體外合成互補(bǔ)DNA(cDNA)，此主要用于真核微生物及動，植物細(xì)胞中特定基因的克��；化學(xué)合成，主要用于那些結(jié)構(gòu)簡單、核苷酸順序清楚的基因的克隆；從基因庫中篩選、擴(kuò)增獲得，目前認(rèn)為是取得任何目的基因的最好和最有效的方法。
載體的選擇 基因工程中所用的載體系統(tǒng)主要有細(xì)菌質(zhì)粒、粘性質(zhì)粒、酵母菌質(zhì)粒、λ噬菌體、動物病毒等。載體一般為環(huán)狀DNA，能在體外經(jīng)限制酶及DNA連接酶的作用同目的基因結(jié)合成環(huán)狀DNA (即重組DNA)，然后經(jīng)轉(zhuǎn)化進(jìn)入受體細(xì)胞大量復(fù)制和表達(dá)。
重組栽體的構(gòu)建 DNA體外重組是將目的基因用DNA連接酶連接到合適的載體DNA上，可采用粘端連接法和末端連接法。
工程菌的獲得 經(jīng)重組DNA的轉(zhuǎn)化與鑒定，得到符合原定的“設(shè)計藍(lán)圖”的工程菌。
4.1. 自然界工業(yè)菌種篩選程序
我國幅員遼闊，各地氣候條件、土質(zhì)條件、植被條件差異很大，這為自然界中各種微生物的存在提供了良好的生存環(huán)境。自然界中微生物種類繁多，估計不少于幾十萬種，但目前已為人類研究及應(yīng)用的不過千余種。由于微生物到處都有，無孔不入，所以它們在自然界大多是以混雜的形式群居于一起的。而現(xiàn)代發(fā)酵工業(yè)是以純種培養(yǎng)為基礎(chǔ)，故采用各種不同的篩選手段，挑選出性能良好、符合生產(chǎn)需要的純種是工業(yè)育種的關(guān)鍵一步。自然界工業(yè)菌種分離篩選的主要步驟是：采樣、增殖培養(yǎng)、培養(yǎng)分離和篩選。如果產(chǎn)物與食品制造有關(guān)，還需對菌種進(jìn)行毒性鑒定。
4.1.1. 采樣
以采集土壤為主。一般在有機(jī)質(zhì)較多的肥沃土壤中，微生物的數(shù)量最多，中性偏堿的土壤以細(xì)菌和放線菌為主，酸性紅土壤及森林土壤中霉菌較多，果園、菜園和野果生長區(qū)等富含碳水化合物的土壤和沼澤地中，酵母和霉菌較多。采樣的對象也可以是植物，腐敗物品，某些水域等。采樣應(yīng)充分考慮采樣的季節(jié)性和時間因素，以溫度適中，雨量不多的秋初為好。因?yàn)檎嬲脑鼐旱某霈F(xiàn)可能是短暫的，如在夏季或冬季土壤中微生物存活數(shù)量較少，暴雨后土壤中微生物會顯著減少。采樣方式是在選好適當(dāng)?shù)攸c(diǎn)后，用無菌刮鏟、土樣采集器等，采集有代表性的樣品，如特定的土樣類型和土層，葉子碎屑和腐質(zhì)，根系及根系周圍區(qū)域，海底水，泥及沉積物，植物表皮及各部，陰溝污水及污泥，反色動物第一胃內(nèi)含物，發(fā)酵食品等。
具體采集土樣時，就森林、旱地、草地而言，可先掘洞，由土壤下層向上層順序采集；就水田等浸水土壤而言，一般是在不損土層結(jié)構(gòu)的情況下插入圓筒采集。如果層次要求不嚴(yán)格，可取離地面5~15cm處的土。將采集到的土樣盛入清潔的聚乙烯袋、牛皮袋或玻璃瓶中。采好的樣必須完整地標(biāo)上樣本的種類及采集日期、地點(diǎn)以及采集地點(diǎn)的地理、生態(tài)參數(shù)等。采好的樣品應(yīng)及時處理，暫不能處理的也應(yīng)貯存于4℃下，但貯存時間不宜過長。這是因?yàn)橐坏┎蓸咏Y(jié)束，試樣中的微生物群體就脫離了原來的生態(tài)環(huán)境，其內(nèi)部生態(tài)環(huán)境就會發(fā)生變化，微生物群體之間就會出現(xiàn)消長。如果要分離嗜冷菌，則在室溫下保存試樣會使嗜冷菌數(shù)量明顯降低。
在采集植物根際土樣時，一般方法是將植物根從土壤中慢慢拔出，浸漬在大量無菌水中約20min，洗去粘附在根上的土壤，然后再用無菌水漂洗下根部殘留的土，這部分土即為根際土樣。
在采集水樣時，將水樣收集于100m1干凈、滅菌的廣口塑料瓶中。由于表層水中含有泥沙，應(yīng)從較深的靜水層中采集水樣。方法是：握住采樣瓶浸入水中30~50cm處，瓶口朝下打開瓶蓋，讓水樣進(jìn)入。如果有急流存在的話，應(yīng)直接將瓶口反向于急流。水樣采集完畢時，應(yīng)迅速從水中取出采集瓶并帶有較大的弧度。水樣不應(yīng)裝滿采樣瓶，采集的水樣應(yīng)在24h之內(nèi)迅速進(jìn)行檢測，或者4℃下貯存。
4.1.2. 增殖培養(yǎng)
一般情況下，采來的樣品可以直接進(jìn)行分離，但是如果樣品中我們所需要的菌類含量并不很多，而另一些微生物卻大量存在。此時，為了容易分離到所需要的菌種，讓無關(guān)的微生物至少是在數(shù)量上不要增加，即設(shè)法增加所要菌種的數(shù)量，以增加分離的幾率。可以通過選擇性的配制培養(yǎng)基（如營養(yǎng)成分、添加抑制劑等），選擇一定的培養(yǎng)條件（如培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基酸堿度等）來控制。具體方法是根據(jù)微生物利用碳源的特點(diǎn)，可選定糖、淀粉、纖維素，或者石油等，以其中的一種為唯一碳源，那么只有利用這一碳源的微生物才能大量正常生長，而其他微生物就可能死亡或淘汰。對G一菌有選擇的培養(yǎng)基(如結(jié)晶紫營養(yǎng)培養(yǎng)基、紅—紫膽汁瓊脂、煌綠膽汁瓊脂等)通常含有5%~10%的天然提取物。在分離細(xì)菌時，培養(yǎng)基中添加濃度一般為50μg／m1的抗真菌劑(如放線菌酮和制霉素)，可以抑制真菌的生長。在分離放線菌時，通常于培養(yǎng)基中加入1~5m1天然浸出汁(植物、巖石、有機(jī)混合腐質(zhì)等的浸出汁) 作為最初分離的促進(jìn)因子，由此可以分離出更多不同類型的放線菌類型；放線菌還可以十分有效地利用低濃度的底物和復(fù)雜底物(如幾丁質(zhì))，因此，大多數(shù)放線菌的分離培養(yǎng)是在貧脊或復(fù)雜底物的瓊脂平板上進(jìn)行的，而不是在含豐富營養(yǎng)的生長培養(yǎng)基上分離的；在放線菌分離瓊脂中通常加入抗真菌劑制霉菌素或放線菌酮，以抑制真菌的繁殖；此外，為了對某些特殊種類的放線菌進(jìn)行富集和分離，可選擇性地添加一些抗生素(如新生霉素)。在分離真菌時，利用低碳／氮比的培養(yǎng)基可使真菌生長菌落分散，利于計數(shù)、分離和簽定；在分離培養(yǎng)基中加入一定的抗生素如氯霉素、四環(huán)素、卡那霉素、青霉素、鏈霉素等即可有效地抑制細(xì)菌生長及其菌落形成；抑制細(xì)菌的另外一些方法有：在使用平皿之前，將平皿先干燥3~4天；降低培養(yǎng)基的pH值或在無法降低pH時，加入1：30000玫瑰紅。這樣有利于下階段的純種分離。
4.1.3. 培養(yǎng)分離
通過增殖培養(yǎng)，樣品中的微生物還是處于混雜生長狀態(tài)。因此還必須分離，純化。在這一步，增殖培養(yǎng)的選擇性控制條件還應(yīng)進(jìn)一步應(yīng)用，而且要控制得細(xì)一點(diǎn)，好一點(diǎn)。同時必須進(jìn)行純種分離，常用的分離方法有稀釋分離法、劃線分離法和組織分離法。稀釋分離法的基本方法是將樣品進(jìn)行適當(dāng)稀釋，然后將稀釋液涂布于培養(yǎng)基平板上進(jìn)行培養(yǎng)，待長出獨(dú)立的單個菌落，進(jìn)行挑選分離。劃線分離法要首先倒培養(yǎng)基平板，然后用接種針（接種環(huán)）挑取樣品，在平板上劃線。劃線方法可用分步劃線法或一次劃線法，無論用哪種方法，基本原則是確保培養(yǎng)出單個菌落。組織分離法主要用于食用菌菌種或某些植物病原菌的分離。分離時，首先用10%漂白粉或0.1%升汞液對植物或器官組織進(jìn)行表面消毒，用無菌水洗滌數(shù)次后，移植到培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基上，于適宜溫度培養(yǎng)數(shù)天后，可見微生物向組織塊周圍擴(kuò)展生長。經(jīng)菌落特征和細(xì)胞特征觀察確認(rèn)后，即可由菌落邊緣挑取部分菌種進(jìn)行移接斜面培養(yǎng)。
對于有些微生物如毛霉、根霉等在分離時，由于其菌絲的蔓延性，極易生長成片，很難挑取單菌落。常在培養(yǎng)基中添加0.1%的去氧膽酸鈉或在察氏培養(yǎng)基中添加0.1%的山梨糖及0.01%的蔗糖，利于單菌落的分離。
4.1.4. 篩選
經(jīng)過分離培養(yǎng)，在平板上出現(xiàn)很多單個菌落，通過菌落形態(tài)觀察，選出所需菌落，然后取菌落的一半進(jìn)行菌種鑒定，對于符合目的菌特性的菌落，可將之轉(zhuǎn)移到試管斜面純培養(yǎng)。這種從自然界中分離得到的純種稱為野生型菌株，它只是篩選的第一步，所得菌種是否具有生產(chǎn)上的實(shí)用價值，能否作為生產(chǎn)菌株，還必須采用與生產(chǎn)相近的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，通過三角瓶的容量進(jìn)行小型發(fā)酵試驗(yàn)，以求得適合于工業(yè)生產(chǎn)用菌種。這一步是采用與生產(chǎn)相近的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，通過三角瓶的容量進(jìn)行小型發(fā)酵試驗(yàn)，以求得適合于工業(yè)生產(chǎn)用菌種。如果此野生型菌株產(chǎn)量偏低，達(dá)不到工業(yè)生產(chǎn)的要求，可以留之作為菌種選育的出發(fā)菌株。
4.1.5. 毒性試驗(yàn)
自然界的一些微生物在一定條件下將產(chǎn)生毒素，為了保證食品的安全性，凡是與食品工業(yè)有關(guān)的菌種，除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草桿菌無須作毒性試驗(yàn)外，其他微生物均需通過兩年以上的毒性試驗(yàn)。
4.2. 微生物的誘變育種
從自然界直接分離的菌種，一般而言其發(fā)酵活力往往是比較低的，不能達(dá)到工業(yè)生產(chǎn)的要求，因此要根據(jù)菌種的形態(tài)、生理上的特點(diǎn)，改良菌種。以微生物的自然變異為基礎(chǔ)的生產(chǎn)選種的幾率并不高，因?yàn)檫@種變異率太小，僅為10—6~10—10。為了加大其變異率，采用物理和化學(xué)因素促進(jìn)其誘發(fā)突變，這種以誘發(fā)突變?yōu)榛A(chǔ)的育種就是誘變育種，它是國內(nèi)外提高菌種產(chǎn)量、性能的主要手段。 誘變育種具有極其重要的意義，當(dāng)今發(fā)酵工業(yè)所使用的高產(chǎn)菌株，幾乎都是通過誘變育種而大大提高了生產(chǎn)性能。誘變育種不僅能提高菌種的生產(chǎn)性能而且能改進(jìn)產(chǎn)品的質(zhì)量、擴(kuò)大品種和簡化生產(chǎn)工藝等。從方法上講，它具有方法簡便、工作速度快和效果顯著等優(yōu)點(diǎn)。因此，雖然目前在育種方法上，雜交、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)以及基因工程、原生質(zhì)體融合等方面的研究都在快速地發(fā)展，但誘變育種仍為目前比較主要、廣泛使用的育種手段。
4.2.1. 誘變育種的步驟和方法
誘變育種的步驟如下（圖5－18）：
圖5－18. 誘變育種的步驟
出發(fā)菌株的選擇 用來進(jìn)行誘變或基因重組育種處理的起始菌株稱為出發(fā)菌株。在誘變育種中，出發(fā)菌株的選擇，會直接影響到最后的誘變效果，因此必須對出發(fā)菌株的產(chǎn)量、形態(tài)、生理等方面有相當(dāng)?shù)牧私�，挑選出對誘變劑敏感性大、變異幅度廣、產(chǎn)量高的出發(fā)菌株。具體方法是選取自然界新分離的野生型菌株，它們對誘變因素敏感，容易發(fā)生變異；選取生產(chǎn)中由于自發(fā)突變或長期在生產(chǎn)條件下馴化而篩選得到的菌株，與野生型菌株較相象，容易達(dá)到較好的誘變效果；選取每次誘變處理都有一定提高的菌株，往往多次誘變可能效果迭加，積累更多的提高。另外，出發(fā)菌株還可以同時選取2~3株，在處理比較后，將更適合的菌株留著繼續(xù)誘變。
另外，對于基因重組的出發(fā)菌株，無論是供體還是受體，都必須考慮與重組方式對應(yīng)的基本性能，如感受態(tài)、性親和性、噬菌體吸附位點(diǎn)等，還必須考慮標(biāo)記互補(bǔ)、選擇性性狀、受菌體的強(qiáng)代謝活性、營養(yǎng)需求、生長速度等，以及與社會公害有關(guān)的問題如耐藥性、致病性、腸道寄生性等。
同步培養(yǎng) 在誘變育種中，處理材料一般采用生理狀態(tài)一致的單倍體、單核細(xì)胞，即菌懸液的細(xì)胞應(yīng)盡可能達(dá)到同步生長狀態(tài)，這稱為同步培養(yǎng)。細(xì)菌一般要求培養(yǎng)至對數(shù)生長期，此時群體生長狀態(tài)比較同步，比較容易變異，重復(fù)性較好。如亞硝基胍誘變時作用于復(fù)制叉處，生長旺盛的細(xì)胞中復(fù)制叉點(diǎn)較多，堿基類似物也在此時期比較容易進(jìn)入DNA鏈中。霉菌處理使用分生孢子，應(yīng)該將分生孢子在液體培養(yǎng)基中短時間培養(yǎng)，使孢子孵化，處于活化狀態(tài)，并恰好未形成菌絲體，易于誘變。
單細(xì)胞(或單孢子) 懸液的制備 這一步的關(guān)鍵是制備一定濃度的分散均勻的單細(xì)胞或單孢子懸液，為此要進(jìn)行細(xì)胞的培養(yǎng)，并收集菌體、過濾或離心、洗滌。菌懸液一般可用生理鹽水或緩沖溶液配制，如果是用化學(xué)誘變劑處理，因處理時 pH值會變化，必須要用緩沖溶液。除此之外，還應(yīng)注意分散度，方法是先用玻璃珠振蕩分散，再用脫脂棉或?yàn)V紙過濾，經(jīng)處理，分散度可達(dá)90％以上，這樣，可以保證菌懸液均勻地接觸誘變劑 ，獲得較好誘變效果。最后制得的菌懸液，霉菌孢子或酵母菌細(xì)胞的濃度大約為106~107個／ml，放線菌和細(xì)菌的濃度大約為108個／ml。菌懸液的細(xì)胞可用平板計數(shù)法、血球計數(shù)板或光密度法測定，但以平板計數(shù)法較為準(zhǔn)確。
誘變處理 首先選擇合適的誘變劑，然后確定其使用劑量。常用誘變劑有兩大類：物理誘變劑和化學(xué)誘變劑。 常用的物理誘變劑有紫外線、x射線、γ射線(如Co60等)、等離子、快中子、α射線、β射線、超聲波等。常用的化學(xué)誘變劑有堿基類似物、烷化劑、羥胺、吖定類化合物等。
物理誘變劑中最常用的有紫外線。由于紫外線不需要特殊貴重設(shè)備，只要普通的滅菌紫外燈管即能做到，而且誘變效果也很顯著，因此被廣泛應(yīng)用于工業(yè)育種。紫外線是波長短于紫色可見光而又緊接紫色光的射線、波長范圍為136～300nm，紫外線波長范圍雖寬，但有效范圍僅限于一個小區(qū)域，多種微生物最敏感的波長集中在265nm處，對應(yīng)于功率為15W的紫外燈。它是一種非電離輻射，當(dāng)物質(zhì)吸收一定能量的紫外線后，它的某些電子將被提升到較高的能量水平，從而引起分子激發(fā)而造成突變；而不吸收紫外線的物質(zhì)，能量不發(fā)生轉(zhuǎn)移，分子也不會激發(fā)，不會產(chǎn)生任何化學(xué)變化，然而，脫氧核糖核酸能大量吸收紫外線，因此它極容易受紫外線的影響而變化。紫外線的誘變作用是由于它引起DNA分子結(jié)構(gòu)變化而造成的。這種變化包括DNA鏈的斷裂，DNA分子內(nèi)和分子間的交連，核酸與蛋白質(zhì)的交聯(lián)，嘧啶水合物和嘧啶二聚體的產(chǎn)生等，特別是嘧啶二聚體的產(chǎn)生對于DNA的變化起主要作用。
紫外誘變的方法是：將10m1菌懸液放在直徑為9cm的培養(yǎng)皿中，液層厚度約為2mm，啟動磁力攪拌器，使用15w功率紫外燈管，照射距離為30cm左右，照射時間以幾秒至數(shù)十分鐘為宜，具芽孢的菌株需處理10 min左右。為準(zhǔn)確起見，照射前紫外燈應(yīng)先預(yù)熱20~30min，然后再進(jìn)行處理。不同的微生物對于紫外線的敏感程度不一樣，因此不同的微生物對于誘變所需要的劑量也不同。在紫外燈的功率、照射距離已定的情況下，決定照射劑量的只有照射時間，這樣可以設(shè)計一個照射不同時間梯度的實(shí)驗(yàn)，根據(jù)不同時間照射的死亡率，作出照射時間與死亡率的曲線，這樣就可以選擇適當(dāng)?shù)恼丈鋭┝俊Ｒ话阋哉丈浜笪⑸锏闹滤缆试?0%~99.9% 的劑量為最佳照射劑量，近來也有傾向于采用殺菌率70%~75%甚至更低(30%~70%)的劑量。一般認(rèn)為，偏低的劑量處理后正突變率較高，而用較高的劑量時則負(fù)突變率較高，但高劑量造成損傷大、回復(fù)少。目前趨向采用低劑量、長時間處理，盡管致死率較高，而誘變效果較好。實(shí)驗(yàn)時，為了避免光復(fù)活現(xiàn)象，處理過程應(yīng)在暗室的紅光下操作，處理完畢后，將盛菌懸液的器皿用黑布包起來培養(yǎng)，然后再進(jìn)行分離篩選。
CO60屬γ射線，是一種高能電磁波，其誘發(fā)的突變率和射線劑量直接有關(guān)，而與時間長短無關(guān)。它能產(chǎn)生電離作用，直接和間接改變DNA結(jié)構(gòu)。直接的效應(yīng)是導(dǎo)致堿基的化學(xué)鍵、脫氧核糖的化學(xué)鍵、糖-磷酸相連接的化學(xué)鍵的斷裂；間接的效應(yīng)是電離輻射使水和有機(jī)分子產(chǎn)生自由基，自由基作用于DNA分子，特別是對嘧啶的作用更強(qiáng)，可引起缺失和損傷，造成基因突變，還能引起染色體斷裂，引起倒位、缺失和易位等畸變。不同的微生物對C060的輻射敏感程度差異很大，可以相差幾倍，引起最高變異的劑量也隨菌種而有所不同。一般照射時多采用菌懸液，也可用長了菌落的平皿直接照射。照射劑量在4~10萬倫琴，或者采用能使微生物產(chǎn)生90％~99％死亡率的劑量。電離幅射是造成染色體巨大損傷的最好誘變劑，它能造成不可回復(fù)的缺失突變，但可能影響鄰近基因的性能。
等離子輸入是一種較新的誘變方法，國外自20世紀(jì)60年代中、后期相繼開始把等離子注入技術(shù)應(yīng)用于生物學(xué)領(lǐng)域的研究，國內(nèi)將離子束作為一種新技術(shù)應(yīng)用于生物等品種改良的研究則是由中國科學(xué)院等離子體物理研究所于1986年開創(chuàng)的。低能離子束是以具質(zhì)量、能量雙重誘變效應(yīng)的特征不同于傳統(tǒng)的電磁輻射，它的注入引發(fā)的生物效應(yīng)，機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜，既有能量的沉積、動量的傳遞，又有粒子的注入和電荷的交換，可導(dǎo)致細(xì)胞表面被刻蝕，引起細(xì)胞膜透性和膜電場的改良，與γ射線，中子束等明顯不同。離子束與生物體作用，首先有能量的沉積，即注入離子與生物大分子發(fā)生一系列碰撞，生物大分子獲得能量時，鍵斷裂，分子擊出原位，留下斷鍵或缺陷；同時還有質(zhì)量沉積，離子束是高LET粒子，有Braag峰，具有較強(qiáng)的電離作用，還能產(chǎn)生活性高的自由基間接損傷作用，因此它對生物體的作用可導(dǎo)致較高的突變率；另外由于注入離子的不同電荷數(shù)、質(zhì)量數(shù)、能量、劑量的組合，提供了眾多的誘變條件，通過這種電、能、質(zhì)的聯(lián)合作用，將強(qiáng)烈影響生物細(xì)胞的生理生化特性，以引起基因突變，所以變異幅度大，有較高的突變率，較廣的突變譜；再者突變體的遺傳性能比較穩(wěn)定，回復(fù)突變率低。
化學(xué)誘變劑 化學(xué)誘變劑的種類很多，根據(jù)它們對DNA的作用機(jī)制，可以分為三大類：第一類是烷化劑，它與一個或多個核酸堿基起化學(xué)變化，因而引起DNA復(fù)制時堿基配對的轉(zhuǎn)換而發(fā)生變異。例如硫酸二乙酯、亞硝酸、甲基磺酸乙酯、N-甲基-N’-亞硝基胍、亞硝基甲基尿等。第二類是一些堿基類似物，它們通過代謝作用滲入到DNA分子中而引起變異，例如 5-溴尿嘧啶、5-氨基尿嘌呤、2-氨基嘌呤、8-氮鳥嘌呤等。第三類是吖啶類，它造成DNA分子增加或減少一、二個堿基，從而引起堿基突變點(diǎn)以下全部遺傳密碼在轉(zhuǎn)錄和翻譯時產(chǎn)生錯誤。選擇化學(xué)誘變劑時還應(yīng)注意：亞硝胺和烷化劑應(yīng)用的范圍較廣，造成的遺傳損傷較多，其中亞硝基胍和甲基磺酸乙酯被稱為“超誘變劑”， 甲基磺酸乙酯是毒性最小的誘變劑之一。堿基類似物和羥胺雖然具有很高的特異性，但很少使用，因其回復(fù)突變率高，效果不大。
決定化學(xué)誘變劑劑量的因素主要有誘變劑的濃度、作用溫度和作用時間�；瘜W(xué)誘變劑的處理濃度常用幾微克~幾毫克／毫升，但是這個濃度取決于藥劑、溶劑及微生物本身的特性，還受水解產(chǎn)物的濃度、一些金屬離子以及某些情況下誘變劑的延遲作用的影響。一般對于一種化學(xué)誘變劑，處理濃度對不同微生物有一個大致范圍，在進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)時，也通常是將處理濃度、處理溫度確定后，測定不同時間的致死率來確定適宜的誘變劑量。這里需要說明的是化學(xué)誘變劑與物理誘變劑不同，在處理到確定時間后，要有合適的終止反應(yīng)方法，一般采用稀釋法、解毒劑或改變pH值等方法來終止反應(yīng)。
要確定一個合適的劑量，通常要經(jīng)過多次試驗(yàn)，就一般微生物而言，誘變頻率往往隨劑量的增高而增高，但達(dá)到一定劑量后，再提高劑量會使誘變頻率下降。根據(jù)對紫外線、x 射線及乙烯亞胺等誘變劑誘變效應(yīng)的研究，發(fā)現(xiàn)正突變較多地出現(xiàn)在較低的劑量中。而負(fù)突變則較多地出現(xiàn)在高劑量中，同時還發(fā)現(xiàn)經(jīng)多次誘變而提高產(chǎn)量的菌株中，高劑量更容易出現(xiàn)負(fù)突變。因此，在誘變育種工作中，目前較傾向于采用較低劑量。
在誘變育種時，有時可根據(jù)實(shí)際情況，采用多種誘變劑復(fù)合處理的辦法。復(fù)合處理方法主要有三類：第一類是兩種或多種誘變劑先后使用；第二類是同一種誘變劑的重復(fù)使用；第三類是兩種或多種誘變劑的同時使用。如果能使用不同作用機(jī)制的誘變劑來做復(fù)合處理，可能會取得更好的誘變效果。誘變劑的復(fù)合處理常呈現(xiàn)一定的協(xié)同效應(yīng)，這對誘變育種的工作是很有價值的。
中間培養(yǎng) 對于剛經(jīng)誘變劑處理過的菌株，有一個表現(xiàn)遲滯的過程，即細(xì)胞內(nèi)原酶有量的稀釋過程（生理延遲），需3代以上的繁殖才能將突變性狀表現(xiàn)出來。據(jù)此應(yīng)讓變異處理后細(xì)胞在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)幾小時，使細(xì)胞的遺傳物質(zhì)復(fù)制，繁殖幾代，以得到純的變異細(xì)胞。這樣，穩(wěn)定的變異就會顯現(xiàn)出來。若不經(jīng)液體培養(yǎng)基的中間培養(yǎng)，直接在平皿上分離就會出現(xiàn)變異和不變異細(xì)胞同時存在于一個菌落內(nèi)的可能，形成混雜菌落，以致造成篩選結(jié)果的不穩(wěn)定和將來的菌株退化。
分離和篩選 經(jīng)過中間培養(yǎng)，分離出大量的較純的單個菌落，接著，要從幾千萬個菌落中篩選出幾個好的，即篩選出所謂性能良好的正突變菌株，這將要花費(fèi)大量的人力和物力。怎樣設(shè)計才能花費(fèi)較少的工作量達(dá)到最好的效果，這是篩選工作中的一條原則。一般采用一些方法加以簡化，如利用形態(tài)突變直接淘汰低產(chǎn)變異菌株，或利用平皿反應(yīng)直接挑取高產(chǎn)變異菌株等。平皿反應(yīng)是指每個變異菌落產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物與培養(yǎng)基內(nèi)的指示物在培養(yǎng)基平板上作用后表現(xiàn)出一定的生理效應(yīng)，如變色圈、透明圈、生長圈、抑菌圈等，這些效應(yīng)的大小表示變異菌株生產(chǎn)活力的高低，以此作為篩選的標(biāo)志。常用的方法有紙片培養(yǎng)顯色法、透明圈法、瓊脂塊培養(yǎng)法等。
4.2.2. 營養(yǎng)缺陷型突變體的篩選及應(yīng)用
在誘變育種工作中，營養(yǎng)缺陷型突變體的篩選及應(yīng)用有著十分重要的意義。營養(yǎng)缺陷型菌株是指通過誘變而產(chǎn)生的缺乏合成某些營養(yǎng)物質(zhì)(如氨基酸、維生素、嘌呤和嘧啶堿基等)的能力，必須在其基本培養(yǎng)基中加入相應(yīng)缺陷的營養(yǎng)物質(zhì)才能正常生長繁殖的變異菌株。其變異前的菌株稱為野生菌株。凡是能滿足野生菌株正常生長的最低成分的合成培養(yǎng)基，稱為基本培養(yǎng)(MM)；在基本培養(yǎng)基中加入一些富含氨基酸、維生素及含氮堿基之類的天然有機(jī)物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、酵母膏等，能滿足各種營養(yǎng)缺陷型菌株生長繁殖的培養(yǎng)基，稱為完全培養(yǎng)基(CM)；在基本培養(yǎng)基中只是有針對性的加入某一種或某幾種自身不能合成的有機(jī)營養(yǎng)成分，以滿足相應(yīng)的營養(yǎng)缺陷型菌株生長的培養(yǎng)基，稱為補(bǔ)充培養(yǎng)基(SM)。
營養(yǎng)缺陷型菌株的篩選一般要經(jīng)過誘變、淘汰野生型菌株、檢出缺陷型和確定生長譜四個環(huán)節(jié)。誘變劑處理時與其它誘變處理基本相同。在誘變處理后的存活個體中，營養(yǎng)缺陷型的比例一般很低，通常只有百分之幾至千分之幾，采用抗菌素法或菌絲過濾法，可以淘汰為數(shù)眾多的野生型菌株，從而達(dá)到濃縮營養(yǎng)缺陷型的目的�？股胤ㄊ抢靡吧途昴茉贛M中生長，而缺陷型不能生長，于是將誘變處理液在MM中培養(yǎng)短時讓野生型生長，處于活化階段，而缺陷型無法生長，仍處于“休眠狀態(tài)”，這時，加入一定量的抗生素，結(jié)果活化狀態(tài)的野生型就被殺死，保存了缺陷型。在選擇抗生素時，細(xì)菌可以用青霉素，酵母可用制霉菌素。 菌絲過濾法只適用于絲狀真菌，其原理是在基本培養(yǎng)基中，野生型的孢子能發(fā)芽成菌絲，而營養(yǎng)缺陷型則不能。因此將誘變處理后的孢子在基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時間后，再進(jìn)行過濾。如此重復(fù)數(shù)次后，就可以除去大部分野生型菌株，同樣達(dá)到“濃縮”營養(yǎng)缺陷型的目的。
營養(yǎng)缺陷型的檢出方法很多，主要有影印法、夾層法、逐個檢出法、限量補(bǔ)充培養(yǎng)法等四種。影印法是將誘變處理后的細(xì)胞涂布在完全培養(yǎng)基表面上，經(jīng)培養(yǎng)后長出菌落，然后用一小塊直徑比平皿稍小的圓柱形木塊復(fù)蓋于滅過菌的絲絨布上作為接種工具，將長出菌落的平皿倒轉(zhuǎn)過來，在絲絨上輕輕按一下，轉(zhuǎn)接到另一基本培養(yǎng)基平板上，經(jīng)培養(yǎng)后，比較這兩個平皿長出的菌落。如果發(fā)現(xiàn)前一平扳上某一部位長有菌落，而在后一培養(yǎng)基上的相應(yīng)部位卻沒有，就說明這是一個營養(yǎng)缺陷型菌落。夾層培養(yǎng)法是先在培養(yǎng)皿上倒一層基本培養(yǎng)基，冷凝后加上一層含菌液的基本培養(yǎng)基，凝固后再澆上一薄層的基本培養(yǎng)基。經(jīng)培養(yǎng)后，在皿底對首先出現(xiàn)的菌落做標(biāo)記，然后再倒上一薄層完全培養(yǎng)基(或補(bǔ)充培養(yǎng)基)，再培養(yǎng)，這時再出現(xiàn)的新菌落，多數(shù)即為營養(yǎng)缺陷型。此法缺點(diǎn)是，結(jié)果有時不明確，而且將缺陷型菌落從夾層中挑出并不很容易。逐個檢出法是將經(jīng)過誘變處理的細(xì)胞涂布在完全培養(yǎng)基平板上，待長出單個菌落后，用接種針或牙簽將這些單個菌落逐個依次地分別接種到基本培養(yǎng)基和另一完全培養(yǎng)基平板上。經(jīng)培養(yǎng)后，如果在完全培養(yǎng)基上長出菌落，而在基本培養(yǎng)基上卻不長菌落，說明這是一個營養(yǎng)缺陷型菌株。限量補(bǔ)充培養(yǎng)法是將誘變處理后的細(xì)胞接種在含有微量(0.01％以下)蛋白胨的基本培養(yǎng)基上。野生型菌株就會迅速生長成較大的菌落，而營養(yǎng)缺陷型菌株只能形成生長緩慢的微小菌落，因而可以識別檢出。如果想得到某一特定缺陷型菌株，則可直接在基本培養(yǎng)基上加入微量的相應(yīng)物質(zhì)。
確定生長譜是指采用上法選出的缺陷型菌株經(jīng)幾次驗(yàn)證確定后，還需確定其缺陷的因子，是氨基酸缺陷型，還是維生素缺陷型，或是嘌呤、嘧啶缺陷型。生長譜測定可以用兩種方法：一種是將缺陷型菌株培養(yǎng)后，收集菌體，洗滌培養(yǎng)基，制備成細(xì)胞懸液后，與MM培養(yǎng)基（融化并涼至50°C）混合并傾注平皿。待凝固后，分別在平皿的5~6個區(qū)間放上不同的營養(yǎng)組合的混合物或吸飽此組織營養(yǎng)物的濾紙圓片，培養(yǎng)后會在組合區(qū)長出，就可測得所需營養(yǎng)。另一種方法是以不同組合的營養(yǎng)混合物與融化涼至50°C的MM培養(yǎng)基鋪成平皿，然后在這些平皿上劃線接種各個缺陷型菌株于相應(yīng)位置，培養(yǎng)后根據(jù)在什么組合長出可推知其營養(yǎng)因子。
營養(yǎng)缺陷型菌株不論在科學(xué)實(shí)驗(yàn)中，還是在生產(chǎn)實(shí)踐中都具有廣泛的用途。利用營養(yǎng)缺陷型菌株定量分析各種生長因素的方法稱為微生物分析法。常用于分析食品中氨基酸和維生素的含量，因?yàn)樵谝欢舛确秶鷥?nèi)，營養(yǎng)缺陷型菌株生長繁殖的數(shù)量與其所需維生素和氨基酸的量成正比。這種方法特異性強(qiáng)，靈敏度高，所用樣品可以很少而且不需提純，也不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備。 利用營養(yǎng)缺陷型菌株作為研究轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合等遺傳規(guī)律的標(biāo)記菌種和微生物雜交育種的標(biāo)記。由于微生物經(jīng)雜交育種后形成的雜種在形態(tài)上往往與親本難以區(qū)別，因此常常選擇不同的營養(yǎng)缺陷型來進(jìn)行標(biāo)記，通過測定后代的營養(yǎng)特性，以判斷它們雜交的性質(zhì)。利用營養(yǎng)缺陷型菌株測定微生物的代謝途徑，并通過有意識地控制代謝途徑，獲得更多的我們所需要的代謝產(chǎn)物，從而成為發(fā)酵生產(chǎn)氨基酸、核苷酸和各種維生素等的生產(chǎn)菌種，例如利用絲氨酸營養(yǎng)缺陷型可以生產(chǎn)更多的賴氨酸，利用腺苷酸營養(yǎng)缺陷型菌株可提高肌苷酸的產(chǎn)量等。
4.3. 微生物的雜交育種
雜交育種是指將兩個基因型不同的菌株經(jīng)細(xì)胞的互相聯(lián)結(jié)、細(xì)胞核融合，隨后細(xì)胞核進(jìn)行減數(shù)分裂，遺傳性狀會出現(xiàn)分離和重新組合的現(xiàn)象，產(chǎn)生具有各種新性狀的重組體，然后經(jīng)分離和篩選，獲得符合要求的生產(chǎn)菌株。盡管一些優(yōu)良菌種的選育主要是采用誘變育種的方法，但是某一菌株長期使用誘變劑處理后，其生活能力一般要逐漸下降，如生長周期延長、孢子量減少、代謝減慢、產(chǎn)量增加緩慢、誘變因素對產(chǎn)量基因影響的有效性降低等。因此，常采用雜交育種的方法繼續(xù)優(yōu)化菌株。另外，由于雜交育種是選用已知性狀的供體和受體菌種作為親本，因此不論在方向性還是自覺性方面，都比誘變育種前進(jìn)了一大步，所以它是微生物菌種選育的另一重要途徑。但由于雜交育種的方法復(fù)雜，工作進(jìn)度慢，因此還很難象誘變育種那樣得到普遍的推廣和應(yīng)用。
4.3.1. 細(xì)菌的雜交
細(xì)菌的雜交行為是于1946年首次在大腸桿菌K-12菌株中發(fā)現(xiàn)并證實(shí)的。首先在大腸桿菌K-12菌株中誘發(fā)一個營養(yǎng)缺陷型(A—)、不能發(fā)酵乳糖(Lac—)和抗鏈霉素(SM r )以及對噬菌體T l敏感的突變體，可以寫成A—B +Lac—SM r T s1；另一菌株誘發(fā)成一個營養(yǎng)缺陷型(B—)，能發(fā)酵乳糖(Lac+)，對鏈霉菌敏感(SM s)和抗噬菌體T l的突變體A+B—Lac +SM s T r 1。這兩個菌株各自都不能在基本培養(yǎng)基上生長，如果把大約105 /ml濃度的上述兩種菌株混合在一起，并接種在基本培養(yǎng)基上，則能長出少數(shù)菌落；如果把上述兩種菌株分別接種到一個特制的U型管的兩端去培養(yǎng),中間用一片可以使培養(yǎng)液流通,但不能使細(xì)菌通過的燒結(jié)玻璃隔開,那么在基本培養(yǎng)基上就不會出現(xiàn)菌落。這說明細(xì)胞的接觸是導(dǎo)致基因重組的必要條件，即細(xì)菌通過接合完成了雜交行為。在鼠傷寒沙門氏菌、綠膿桿菌、肺炎克氏桿菌、霍亂弧菌等許多細(xì)菌中也發(fā)現(xiàn)了沒接合現(xiàn)象，但是至今未在革蘭氏陽性菌中發(fā)現(xiàn)接合現(xiàn)象。細(xì)菌的雜交還可以通過F因子轉(zhuǎn)移,轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)等發(fā)生基因重組,但通過這些方式進(jìn)行雜交育種獲得成功的報道還不多。
4.3.2. 放線菌的雜交育種
放線菌的基因重組于1955年至1957年首先在天藍(lán)鏈霉菌中發(fā)現(xiàn),以后在其它科、屬、種中相繼發(fā)現(xiàn)�，F(xiàn)在常用的放線菌雜交方法主要有三種,即混合培養(yǎng)法、平板雜交法和玻璃紙轉(zhuǎn)移法。國外在金霉素、土霉素、新生霉素等抗生素產(chǎn)生菌的雜交育種方面都有過成功的報道,在我國幾乎與國外同時起步開展放線菌基因重組的研究工作,并取得了一定成效。
4.3.3. 酵母的雜交育種
一般而言，雜交育種運(yùn)用了酵母的單雙倍生活周期，將不同基因型和相對的交配型的單倍體細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)雜交而形成二倍體細(xì)胞，經(jīng)篩選便可獲得新的遺傳性狀。酵母的雜交方法有孢子雜交法，群體交配法，單倍體細(xì)胞雜交法和罕見交配法。就啤酒酵母而言，運(yùn)用罕見交配法更易獲得結(jié)果。
4.3.4. 霉菌的雜交育種
霉菌的雜交育種主要是通過體細(xì)胞的核融合和基因重組，即通過準(zhǔn)性生殖過程而不是通過性細(xì)胞的融合。
霉菌的雜交育種的步驟為：第一 選擇直接親本。用來進(jìn)行雜交的兩個野生型菌株叫原始親本。原始親本經(jīng)過誘變以后得到各種突變型菌株,假設(shè)這種菌株是用來作為形成異核體的親本,就叫直接親本。作為直接親本的遺傳標(biāo)記有多種，如營養(yǎng)突變型、抗藥突變型、形態(tài)突變型等,目前應(yīng)用普遍的是營養(yǎng)缺陷型菌株。第二是異核體的形成。在基本培養(yǎng)基上,強(qiáng)迫兩株?duì)I養(yǎng)缺陷型互補(bǔ)營養(yǎng)，則這兩個菌株經(jīng)過菌絲細(xì)胞間的吻合形成異核體。由直接親本形成異核體的方法有：完全培養(yǎng)基液體混合培養(yǎng)法、完全培養(yǎng)基斜面混合培養(yǎng)法、液體有限培養(yǎng)基混合培養(yǎng)法、有限培養(yǎng)基平板異核叢形成法、基本培養(yǎng)基斜面銜接接種法、基本培養(yǎng)基平板穿刺法等。第三是雙倍體的檢出，檢出雙倍體的方法有很多種，如用放大鏡觀察異核體菌落表面，如果發(fā)現(xiàn)有野生型顏色的斑點(diǎn)和扇面，即可用接種針將其孢子挑出，進(jìn)行分離純化，即得雜合雙倍體�；蛘邔⒋罅慨惡梭w孢子分離于基本培養(yǎng)基平板上從中長出野生型原養(yǎng)性菌落，將其挑出分離純化，即得雜合雙倍體。第四是分離子的檢出�？梢杂眠x擇性培養(yǎng)基篩選分離子，也可以將雜合雙倍體單孢子分離于完全培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)至菌落成熟，檢查大量雙倍體菌落，在一些菌落上有突變顏色（隱性標(biāo)記）的斑點(diǎn)或扇面出現(xiàn)，從每個菌落接出一個斑點(diǎn)或扇面的孢子于完全培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)后經(jīng)過純化和鑒別即得分離子。
4.4. 原生質(zhì)體育種
原生質(zhì)體育種技術(shù)主要有原生質(zhì)體融合、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，原生質(zhì)體誘變育種等。原生質(zhì)體融合育種是基因重組的一種重要方法，由于它具有一系列的特點(diǎn)，所以目前已為國內(nèi)外微生物育種學(xué)者所廣泛研究和應(yīng)用。
由于細(xì)胞壁是微生物細(xì)胞之間進(jìn)行物質(zhì)交換的主要障礙之一，用一些方法將細(xì)胞壁去除后在高滲條件下形成類似球形的原生質(zhì)體，在原生質(zhì)體融合時又加入融合促進(jìn)劑聚乙二醇（PEG）和Ca++，所以微生物原生質(zhì)體間的雜交頻率都明顯高于常規(guī)雜交法，霉菌與放線菌已達(dá)10—l ~10—2，細(xì)菌與酵母已達(dá)10-5~10-6。原生質(zhì)體融合受接合型或致育型的限制較小，二親株中任何一株都可能起受體或供體的作用，因此有利于不同種屬間微生物的雜交。已報道的絲狀真菌種間的原生質(zhì)體融合主要是曲霉屬和青霉屬；屬間原生質(zhì)體融合主要在酵母中實(shí)現(xiàn)：熱帶假絲酸母×飾針復(fù)膜孢酵母，釀酒酵母×彭貝裂殖酵母等。原生質(zhì)體融合是二親株的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核進(jìn)行類似的合二為一的過程，因此可以想象遺傳物質(zhì)的交換更為完整，提高菌株產(chǎn)量的潛力更大。原生質(zhì)體融合可以是兩株以上的親株同時參與融合，如研究表明兩個親株的融合頻率為2.8×10-2，三個親株的融合頻率為4×10-4，四個親株的融合頻率為4.9×10-7。
原生質(zhì)體融合育種的步驟是：標(biāo)記菌株的篩選和穩(wěn)定性驗(yàn)證 ，原生質(zhì)體制備，等量原生質(zhì)體加聚乙二醇促進(jìn)融合，涂布于再生培養(yǎng)基、再生出菌落，選擇性培養(yǎng)基上劃線生長、分離驗(yàn)證、挑取融合子進(jìn)一步試驗(yàn)保藏，生產(chǎn)性能篩選。
前面已經(jīng)提到轉(zhuǎn)化在工業(yè)微生物遺傳改良及基因工程中占有十分重要的地位。但除少數(shù)細(xì)菌外，多數(shù)微生物的自然轉(zhuǎn)化能力很低，特別是真核微生物幾乎很少能發(fā)現(xiàn)自然轉(zhuǎn)化。這主要是因?yàn)檗D(zhuǎn)化的必備條件之一是感受態(tài)的存在，經(jīng)過人工誘導(dǎo)法可使一些微生物獲得感受態(tài)，已成功的例子如枯草芽抱桿菌、大腸桿菌等并得到廣泛應(yīng)用。但在鏈霉菌及真菌中，人工誘導(dǎo)法實(shí)現(xiàn)完整細(xì)胞的轉(zhuǎn)化的成功例子就不多了。原生質(zhì)體技術(shù)出現(xiàn)后不久，Bibb等發(fā)現(xiàn)，當(dāng)有PEG存在時，質(zhì)粒DNA可以很高頻率轉(zhuǎn)化鏈霉菌原生質(zhì)體，從而徹底擺脫了轉(zhuǎn)化依賴感受態(tài)出現(xiàn)的限制。在真菌中巳成功地進(jìn)行原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的菌株如釀酒酵母、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉、米曲霉等。
圖5－19. 基因工程技術(shù)的主要操作步驟示意圖
4.5. 基因工程技術(shù)用于工業(yè)菌種改良
基因工程技術(shù)又稱基因操作、基因克隆、DNA重組等，是一個將含目的基因DNA片段經(jīng)體外操作與載體連接，轉(zhuǎn)入一個受體細(xì)胞并使之?dāng)U增、表達(dá)的過程。因此比其它育種方法更有目的性和方向性，效率更高。其全部過程大體可分為以下6個步驟（如圖5－19）：目的基因的獲得；載體的選擇；含目的基因的DNA片段克隆入載體中構(gòu)成重組載體；將重組載體引入宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制、擴(kuò)增；篩選出帶有重組目的基因的轉(zhuǎn)化細(xì)胞；鑒定外源基因的表達(dá)產(chǎn)物。
目的基因的獲得 目的基因的獲得一般有四條途徑；從生物細(xì)胞中提取、純化染色體DNA并經(jīng)適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶部分酶切；經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶的作用由mRNA在體外合成互補(bǔ)DNA(cDNA)，此主要用于真核微生物及動，植物細(xì)胞中特定基因的克��；化學(xué)合成，主要用于那些結(jié)構(gòu)簡單、核苷酸順序清楚的基因的克隆；從基因庫中篩選、擴(kuò)增獲得，目前認(rèn)為是取得任何目的基因的最好和最有效的方法。
載體的選擇 基因工程中所用的載體系統(tǒng)主要有細(xì)菌質(zhì)粒、粘性質(zhì)粒、酵母菌質(zhì)粒、λ噬菌體、動物病毒等。載體一般為環(huán)狀DNA，能在體外經(jīng)限制酶及DNA連接酶的作用同目的基因結(jié)合成環(huán)狀DNA (即重組DNA)，然后經(jīng)轉(zhuǎn)化進(jìn)入受體細(xì)胞大量復(fù)制和表達(dá)。
重組栽體的構(gòu)建 DNA體外重組是將目的基因用DNA連接酶連接到合適的載體DNA上，可采用粘端連接法和末端連接法。
工程菌的獲得 經(jīng)重組DNA的轉(zhuǎn)化與鑒定，得到符合原定的“設(shè)計藍(lán)圖”的工程菌。