DNA提取緩沖液:100mM Tris-HCl(pH8.0),20mM EDTA(pH8.0),1.5M NaCl,2% CTAB(W/V),4% PVP40(W/V)和2%巰基乙醇(V/V),PVP和巰基乙醇使用前加入5M KAc

    方法一和二,是大同小異.主要是DNA提取液配方不一樣！成本也不一樣！

三、真菌菌絲的總RNA的提取

1.實(shí)驗(yàn)試劑

(1)RNA提取緩沖液(CTAB):2% CTAB(W/V),2% 聚乙烯吡咯烷酮PVP(W/V),100mM Tris-HCl(pH8.0,DEPC處理的水配置),25mM EDTA,0.5g/L 亞精胺Spermidine,2.0M NaCl,2%巰基乙醇(V/V,使用前加入).由于在高溫滅菌條件下,Tris-HCl要和DEPC發(fā)生反應(yīng),所以配RNA提取緩沖液時(shí)直接用DEPC 處理的水配制即可

(2)SSTE:1 M NaCl,0.5% SDS(W/V),10mM Tris-HCl pH8.0,1.0mM EDTA

(3)10M LiCl 直接用蒸餾水配10M LiCl,加1‰的DEPC過(guò)夜后,高溫滅菌

(4)3M NaAc

(5)氯仿:異戊醇(24:1)

(6)酚(pH4.5):氯仿:異戊醇(25:24:1)

(7)DEPC處理水 用1‰的DEPC處理蒸餾水過(guò)夜,高溫滅菌

(8)無(wú)水乙醇;70%酒精

2.實(shí)驗(yàn)步驟

(1)實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說(shuō)了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5):氯仿:異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的氯仿:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過(guò)夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)抽提兩次,氯仿:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無(wú)水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測(cè)RNA的質(zhì)量

(在抽提過(guò)程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

注意：提取RNA請(qǐng)盡量在低溫下操作,如果條件不容許,在室溫下操作的時(shí)間要盡可能的短.