4. 擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)多條帶 （雜帶）

（1）引物用量偏大，引物的特異性不高。應(yīng)調(diào)換引物或降低引物的使用量。

（2）循環(huán)的次數(shù)過多。適當(dāng)增加模板的量，減少循環(huán)次數(shù)。

（3）酶的用量偏高或酶的質(zhì)量不好，應(yīng)降低酶量或調(diào)換另一來源的酶。

（4）退火溫度偏低，退火及延伸時間偏長。應(yīng)提高退火溫度，減少變性與延伸時間，也可采用二種溫度的PCR擴(kuò)增。以2度為梯度設(shè)計梯度PCR反應(yīng)優(yōu)化退火溫度。

（5）樣品處理不當(dāng)。

（6）Mg²⁺濃度偏高，因適當(dāng)調(diào)整Mg²⁺使用濃度。

（7）若為PCR試劑盒，也可能時試劑盒本身質(zhì)量有問題。

（8）復(fù)制提前終止。使用非熱啟動的聚合酶時常有發(fā)生。冰上準(zhǔn)備反應(yīng)體系或采用熱啟動聚合酶。

（9）反應(yīng)緩沖液未全融化或未充分混勻。確保反應(yīng)緩沖液融化全并徹底混勻。

（10）引物特異性差。利用BLAST檢查引物特異性或重新設(shè)計引物。

（11）引物量過多。減少反應(yīng)體系中引物的用量。

（12）模板量過多。質(zhì)粒DNA的用量應(yīng)<50ng，而基因組DNA則應(yīng)<200ng。

（13）外源DNA污染。確保操作的潔凈。