由于現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，DNA合成已廣泛采用DNA自動(dòng)合成儀，僅有少數(shù)特殊情況下采用人工合成。目前，主要有ABI(Applied Biosystem Inc.) 。Pharmacia、Backman等幾家公司生產(chǎn)DNA/RNA合成儀，其中以ABI公司的儀器占我國(guó)及世界市場(chǎng)的80～90%。由于合成技術(shù)的現(xiàn)代化，人們已從繁重的勞動(dòng)中得到解脫。輸入合成儀的DNA序列，可以在數(shù)小時(shí)之內(nèi)得到完成。我們所要做的工作只是合成柱取下，進(jìn)行DNA切落和去保護(hù)基以及純化，并進(jìn)行量鑒定和計(jì)算合成率。
1. DNA合成儀的操作（略）
2. DNA原切落及去保護(hù)
取下DNA合成柱，置適量濃氨水(氫化銨，28%)中浸泡，一般為1ml氫氧化銨密封后55℃保溫：～15小時(shí)，或70℃保溫2小時(shí)，使合成的寡核苷酸片段從載體上切落并去除β-腈乙基磷酸保護(hù)基。
3.寡核苷酸片段的純化
1）.NAP柱純化：由Pharmacia公司生產(chǎn)，主要成分為Sephadex G-25，經(jīng)特殊處理后裝成的不同體積的小柱常用的有NAP-10。含寡核苷酸片段的氨水溶液，調(diào)整體積為1ml加樣于NAP-10柱上(使用前，以15ml雙蒸水平衡柱子)以1ml雙蒸水洗脫，收集洗脫下的液體，即為純化的寡核苷酸，NAP-10柱可以純化長(zhǎng)度在10mer以上的寡核苷酸，產(chǎn)率在90%以上。經(jīng)NAP-10柱純化后樣品中鹽的含量少于3%，完全可以滿足實(shí)驗(yàn)的需要。
2）.丙烯酰胺凝膠電泳純化，從合成柱上洗脫的寡核苷酸片段，冰凍、干燥、去氨水，溶于適量水中后，占樣于15～20%丙烯酰胺凝膠制備膠上，按10V/cm條件電泳，過(guò)夜。電泳完畢后，取下凝膠于EB染色后觀察，或直接將含寡核苷酸片段的凝膠置于硅膠熒光板上(CMC板)紫外線燈下，根據(jù)分子量的標(biāo)準(zhǔn)切下所需的區(qū)段
(呈黑色)，將膠塊置少量緩沖液(10mmol/L Tris? HCl，pH8.0，1mmol/L EDTA 300mmol/LNaCl)，搗碎膠塊，25～42℃浸泡過(guò)夜(4～24小時(shí))，或?qū)⒛z塊置于有少量緩沖液的透析袋中，通電下，寡核苷酸片段即進(jìn)入透折袋中。洗脫的寡苷酸核片段以酒精沉淀、洗滌，真空抽干后即可應(yīng)用。
浸泡法簡(jiǎn)單，成本低，易操作。電泳法較快，回收產(chǎn)率高，但需鑒定。此外還有HPLC(高效液相層析)，及寡核苷酸純合柱(OPC，ABI生產(chǎn))等方法可以純化寡核苷酸片段�？梢愿鶕�(jù)手頭的材料，儀器及使用習(xí)慣而加以選擇。
4.寡核苷酸片段的鑒定
可以采用PAGE、HPLC、FPLC等方法對(duì)合成的寡核苷酸進(jìn)行鑒定。對(duì)于10～100mer的寡核苷酸，可以用20%濃度的丙烯酰胺凝膠電脈，觀察電泳區(qū)帶即可判斷合成片段的純度及片段大小。如果結(jié)合5′或3′末端核素標(biāo)記放射自顯影技術(shù)則結(jié)果更加可靠。采用FPLC和HPLC鑒定合成片段的純度，速度快，精確度高，但需昂貴的儀器設(shè)備。合成片段最精確的鑒定方法是采用Maxam-Gilbert化學(xué)法測(cè)定核苷酸序列。
5.合成產(chǎn)物中DNA含量的測(cè)定
4種堿基的平均最大吸收波長(zhǎng)為260nm。一般選用該波長(zhǎng)測(cè)定DNA含量。測(cè)定前，稀釋樣品，使光吸收在0.2～1.2OD范圍內(nèi)。在石英比色杯中測(cè)定樣品溶液光密度。
表14-1 合成寡核苷酸片段粗產(chǎn)量
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合成柱規(guī)格(m mol) |
粗產(chǎn)量(OD260) |
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0.2 |
20～25 |
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1.0 |
100～125 |
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10.0 |
800～1000 |
產(chǎn)量=OD260×25=OD260實(shí)測(cè)值×稀釋倍數(shù)×體積×25(m g/ml)一般認(rèn)為對(duì)單鏈寡核苷酸片段，1OD260=25m g/ml。
不同規(guī)格合成柱產(chǎn)量均不一樣。