近10年來，現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)越來越廣泛地被用于人類疾病研究的諸領(lǐng)域，為了解病理狀態(tài)下基因組DNA的變化積累了新資料。目前認(rèn)為，人類基因組并非人們想像的那樣穩(wěn)定，諸如基因重排、擴(kuò)增、缺失，突瘺和DNA甲基化類型改變等時有發(fā)生，這些改變對于基因表過和調(diào)控，以及疾病過程的發(fā)展與轉(zhuǎn)歸等方面均具有重要意義。
醫(yī)院病理科檔案中積存的大量石蠟包埋組織，是一個可靠的分子生物學(xué)研究的材料來源。在石蠟切片上進(jìn)行原位雜交或原位PCR分析的分子生物學(xué)方法，是免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)的重要延伸。通過對DNA或mRNA分析亦可直接證實(shí)或補(bǔ)充免疫細(xì)胞化學(xué)的發(fā)現(xiàn)。這些對開礦學(xué)延伸。通過對DNA或mRNA 分析亦可直接證實(shí)或補(bǔ)充免疫細(xì)胞化學(xué)的發(fā)現(xiàn)。這些對形態(tài)學(xué)家較為熟悉的原位分子生物學(xué)技術(shù)，本節(jié)不再贅述。Goelz(1985)和Dubeau等（1986 ）成功地從蠟塊中提取出高質(zhì)量的DNA，完全可以滿足某些腫瘤分子生物學(xué)研究的需要， 結(jié)束了DNA研究依賴于新鮮或冰凍的探針，診斷與鑒別診斷研究和患者預(yù)后評估等方面均具有重要價值。本節(jié)重點(diǎn)討論石蠟包埋組織DNA提取的方法學(xué)及其潛在的應(yīng)用前景。
一、石蠟包埋組織DNA提取的基本方法
從石蠟包埋組織中提取DNA的基本步驟，是在常規(guī)DNA提取方法的基礎(chǔ)上改良和演變而業(yè)。Goelz等（1985）最先提出的石蠟包埋組織DNA提取技術(shù)，是用機(jī)械的方法破碎組織，切除多余的石蠟，進(jìn)入含SDS和高濃度蛋白酶K（１mg/ml）的提取緩沖液加溫孵育，然后進(jìn)行苯酚和氯仿抽提。 所得DNA雖不完整，但可被限制性內(nèi)切酶切割，因而適于點(diǎn)雜交，印跡雜交等多種分了生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。Dubeau等（1986）在上述方法上作了改進(jìn)。 首先通過組織切片和二甲苯和脫蠟，保證了組織的完全破碎，使細(xì)胞與消化液充分接觸，使DNA釋放和蛋白去除更加完全；其次通過兩步消化的方法，將不適于做分子雜交的降解的DNA小段去除，僅保留那些可螺旋化的完整的DNA分子，從而提DNA質(zhì)量，適于做Sorthern印跡雜交分析。Moerkerk等（1990）對上述兩種方法進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)兩種方法所提行DNA之點(diǎn)雜交結(jié)果一致，非螺旋化DNA亦不影響雜交分析。
Goelz氏DNA提取方法的主要步驟
.切除多余石錯，暴露組織
.將組織切碎（最大徑<0.5mm），稱重；
3.溶于TE9提取液(組織<50mg/5ml.50－500mg/10ml),高速混懸2－3min，于48℃放置24h
ＴＥ９提取液的制備
500mmol/L Tris
20mmol/L EDTA
10mmol/L NaCl
1％ SDS
500 μg/ml 蛋白酶Ｋ
pH8.0
4.再次混懸組織，加入蛋白酶Ｋ至終濃度１mg/ml，SDS至２％，孵育40h；
5.用等體積酚－氯仿溶液抽提３次；
6.2.5倍體積乙醇沉淀DNA
7.-70℃放置２－４h
8.9 000xg離心１h
9.沉淀物用70％乙醇洗１次
0.干燥，TE（pＨ7.2）溶解。
不同類型的基因分析所要求的DNA質(zhì)量和數(shù)量不同。Southern 印跡雜交分析需要10－15μg大片段DNA（>20kb），因?yàn)殡s交前要進(jìn)行相誚的限制性內(nèi)切酶消化和凝膠分離不同片段長度的DNA。故DNA提取要求高，小片段DNA存在會直接影響雜交信號。與之相反，多聚酶鏈反應(yīng)（PCR）則可在相對粗制的小片段DNA存在會直接影響雜交信號。與之相反，多聚酶鏈反應(yīng)（PCR）則可在相對粗制的小片段DNA樣本上進(jìn)行，分析所需的DNA很少，0.5μg甚至更少即可。PCR的模板DNA制備方法很多，除上述兩種方法外，還有更簡便的直接水煮法（Slebos,et al,1990；Smit, et al, 1988 ）、 蛋白酶消化法（Impraimet al.1987；Brice,et al.1989）。
這些方法不經(jīng)過酚－氯仿－異戊醇抽提、DNA純化等步驟，直接將組織放在去離子水中煮沸10min 或在蛋白酶Ｋ緩沖液中消化４h，DNA即可釋放出來。此提取物可直接用作模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 但是，我們發(fā)現(xiàn)直接水煮法和蛋白酶消化法提取的DNA，擴(kuò)增率較低，且征對性不好。這可能是由于DNA附著的蛋白質(zhì)去除不凈而影響DNA變性和與引物的結(jié)合，亦可能是由于標(biāo)本中殘留的固定劑等成分對Taq DNA多聚酶的抑制所致。
二、影響DNA提取質(zhì)量的因素
1．固定劑對DNA的影響固定劑的類型直接影響提取DNA的質(zhì)量。目前大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室常用的中性緩沖福爾馬林固定的標(biāo)本，DNA保存完好，可以獲得高分子量DNA。Watford等（1988）對甲醛固定過程中DNA變化進(jìn)行了觀察，發(fā)現(xiàn)核酸對甲醛反應(yīng)性可分為兩個階段：①早期出現(xiàn)堿基快速可逆轉(zhuǎn)羥甲基化；②數(shù)天后堿基對間核酸與蛋白間緩慢地形成亞甲基交聯(lián)。DNA提取過程中的蛋白產(chǎn)K消化，酚/氯仿抽提和純化等步驟，可以消除由于固定所造成的DNA某些理化性質(zhì)改變。Barmwell等（1988）發(fā)現(xiàn)，甲醛和戊二醛固定可使得DNA產(chǎn)量降低，醋酸甲醇（MAA）可導(dǎo)致DNA明顯降解。Michel's運(yùn)輸保存液或PBS存放組織雖提取DNA純度高，但產(chǎn)量得明顯降低。Dubeau等也觀察到含苦味酸（Bouin氏液）和含氯化汞的固定液（Zenker，Bs）處理標(biāo)本不能獲得完整的DNA。乙醇被認(rèn)為是保存核酸的最佳固定劑。Wu等（1990）用無水乙醇固定標(biāo)本48h，最長達(dá)2年，均可得到中量的高分子DNA。每mm3乙醇固定標(biāo)本平均DNA產(chǎn)量為26.6μg，高于新鮮標(biāo)本（19.4/mm3）。
經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化后，乙醇固定組織DNA均顯示由于重復(fù)DNA序列存在所產(chǎn)生的特征性內(nèi)切酶消化后，乙醇固定組織DNA均顯示由于重復(fù)DNA序列存在所產(chǎn)生的特性衛(wèi)星帶，說明DNA被完全消化。Southern印跡雜交結(jié)果與冰凍組織一致。Sato等（1990）用AMex方法處理組織，既可保存許多抗原成分，亦可使大分量DNA完好無損。其基本方法為：將組織放至4℃丙酮浸透，移至－20℃過夜。然后再用丙酮分別在4℃和室溫脫水各15min，苯甲酸透明兩次，每次15min，最后60℃真空浸蠟2－3h，石蠟包埋。結(jié)果顯示，每10mgAMex法處理的溫重組織提得高分子量DNA71.4?4.53μg，與新鮮組織產(chǎn)量相當(dāng)（70.4?3.76μg）。酶切、電泳和雜交反應(yīng)亦相同于新鮮組織。提示AMex法是一種多用途組織處理技術(shù)，可以克服由于DNA降解、高分子量DNA減少和內(nèi)切不完全消化所產(chǎn)生的電泳類型改變，是一種理想的DNA保存方法，特別適用于對開礦學(xué)、免疫表型和基因改變的相關(guān)分析。
2．固定時間對DNA的影響固定過程中所發(fā)生的組織反應(yīng)至今尚未被完全理解，雖然理論上講室溫下福爾馬林與DNA幾乎不發(fā)生的，但已發(fā)現(xiàn)堿基與組蛋白之間的甲基交聯(lián)。這福爾馬林介導(dǎo)的甲基化直接影響DNA提取的效率。如果事實(shí)果真如此，那么固定時是一個重要的變異因素。然而，Goelz等，沒有發(fā)現(xiàn)固定時間對DNA提取量的明顯影響。Dubeau等認(rèn)為組織固定時間太短或太長均會導(dǎo)致DNA的降解。該作者對固定12h到5天不同時間間隔標(biāo)本的DNA提取顯示，隨著固定時間的延長，可螺旋化（Spoolable）的高分子量DNA明顯減少。固定5天后可螺旋化DNA提取率僅有8％。Warford等也發(fā)現(xiàn)單細(xì)胞懸液經(jīng)30min福爾馬林固定后，DNA產(chǎn)量減少到30％，由此可見，不同標(biāo)本對不同固定劑所需的最佳固定時間應(yīng)模索選定。根據(jù)Dubeau等經(jīng)驗(yàn)，常規(guī)組織固定應(yīng)在12h以上至110h之內(nèi)。
3．固定溫度等其他因素對DNA的影響核酸與固定劑的反應(yīng)由反應(yīng)成分、濃度、酸鹼度以及溫度等因素的調(diào)節(jié)，其中溫度效應(yīng)顯得特別重要。室溫下DNA雙股螺旋鏈表現(xiàn)為兩條由氫鍵連接的互補(bǔ)多聚核苷酸；加熱到65℃時，氫鍵開始斷裂；約90℃時，產(chǎn)生兩條單鏈分子。最近，Koshiba等發(fā)現(xiàn)福爾馬林固定過程中的DNA降解，是由于固定溫度高，pH低以及甲酸的存在所致。通過應(yīng)用緩沖福爾馬林和低溫下固定（4℃），可以明顯改善DNA保存。酸性環(huán)境中DNA的降解已有過深入的研究。一般認(rèn)為，強(qiáng)酸可導(dǎo)致DNA的完全解聚，而弱酸也能引起一些結(jié)構(gòu)改變。當(dāng)pH達(dá)到2.5惟下時，幾乎所有堿基之間氫鍵解離，使DNA雙鏈斷裂而產(chǎn)生不可逆的變性；隨后出現(xiàn)N－糖苷鍵水解，使嘌呤殘基游離；最多，多聚核苷之磷酯鍵緩慢水解，僅殘留具有完整嘧啶的多聚脫氧核糖短臂。上述改變亦受溫度或離子強(qiáng)度的影響。加入鹽或降低溫度可穩(wěn)定氫鍵，因而可防止酸性條件下的DNA變性。然而，既使福爾馬林被氫氧化鈉中和，在室溫下DNA亦發(fā)生降解，提示福爾馬林本身即可降解DNA。福爾馬林中DNA降解的機(jī)理及其預(yù)防有待于進(jìn)一步研究。
4．組織處理過程對DNA的影響我們發(fā)現(xiàn)，從常規(guī)組織處理的蠟塊中提取的DNA，其大部分分子量晨100bp－10000bp之間，主要分布于100－1500bp，僅約1/3的組織所提取DNA>20kb。這除與固定劑、固定時間等因素有關(guān)以外，可能的原因還有：①組織從外科切除到固定之間的時間長短下一。當(dāng)組織未固定或固定不充分時，核酸酶可自由作用；②不同腫瘤中核酸酶的水平不一，其在固定前或固定后均不發(fā)揮作用；③蠟塊貯存的地間長短不一。雖然本所獲得的DNA分子量大�？赡芟瀴K中仍存在導(dǎo)致DNA降解的因素。組織的浸蠟和包埋溫度過高或時間過長，均可導(dǎo)致DNA彎性，而產(chǎn)生單鏈DNA片段。單鏈DNA不能被限制性內(nèi)切酶所消化，可導(dǎo)致電泳時泳動速率變慢。
三、提高DNA提取質(zhì)量的方法
1．蠟塊的選擇從福爾馬林固定的組織中未能提出完整的高分子量DNA的重要原因之一，是應(yīng)用了固定不充分的組織。因此，在DNA提取前應(yīng)檢查組織切片。如果有自溶、退變或組織結(jié)構(gòu)不清，大片出血等改變的蠟塊不能用；若有明顯壞死存在的蠟塊，最好不用或?qū)乃啦糠智腥ズ笤儆谩１M可能地選用新近標(biāo)本，緩沖福爾馬林、丙酮和乙醇固定者最佳。
2．DNA提取方法學(xué)的改善為了提高石蠟包埋組織DNA提取的質(zhì)量和效益，人們不同方面進(jìn)行了探索。其中在DNA提取液的改良，蛋白酶的消地間的DNA純化等問題上取得了進(jìn)展。①DNA提取液主要為含SDS和蛋白酶K的TE緩沖液。固定和包埋組織由于化學(xué)修飾作用，使得DNA與蛋白質(zhì)不易分離。因此，必須增加SDS和蛋白酶K的濃度和作用時間：SDS可增至1％-2％，蛋白酶K可分次加入，并注意不時震搖，使酶與組織充分接觸。Koshiba等尿素和胍（guanidine）是DNA自然和人工交聯(lián)最有力的剝脫劑，2－巰基乙醇可干擾二硫鍵，促進(jìn)蛋白變性。作者對DNA提取液進(jìn)行了改良，加入高濃度（4mol/L）尿素和2－羥基乙醇。應(yīng)用此緩沖液，有效地從包埋組織中獲得了高質(zhì)量DNA。②DNA釋放率對于不同蝗組織類型是有差異的，最決于組織細(xì)胞密度和細(xì)胞外間質(zhì)的多少。對于細(xì)胞豐富、含有很少間質(zhì)的組織（例如脾臟），通過24h孵育80％以上DNA可釋放出來；相同量的DNA釋放對于富含致密間質(zhì)的子宮肌瘤則需要6天時間；轉(zhuǎn)移性畸胎瘤含中等細(xì)胞密度和疏松的間質(zhì)，DNA釋放率亦為中等。由此可見，對不同類型的組織DNA提取，蛋白酶K的孵育時間可作適當(dāng)調(diào)整，以求大量地獲取大分子DNA。此外，對于Dubeau等提出的DNA提取過程中分次消化步驟的必要性，也有人提出異議。因?yàn)榈汀⒅蟹肿恿康暮怂岽嬖趯ο拗菩詢?nèi)切酶的消化和雜交不起作用。③Dubeau等發(fā)現(xiàn)，不適于進(jìn)行酶切反應(yīng)和雜交研究的化學(xué)修飾的DNA，可通過攪起完整的DNA而被動除去，因而強(qiáng)調(diào)了螺旋化（spooling）在DNA純化中的重要性。該作者還發(fā)現(xiàn)延長組織固定時間的影響之一就是減少了可螺旋化DNA的量，雜交分析顯示，螺旋化DNA雜交信號強(qiáng)，而未螺旋化DNA信號減弱。因此，增加DNA螺旋化可提高提取DNA質(zhì)量和雜交效率。但是，Moerkert等認(rèn)為未螺旋化DNA不影響進(jìn)行點(diǎn)雜交分析。
3．免疫DNA機(jī)械性損傷福爾馬林固定和石蠟包埋使組織變得堅韌，很難達(dá)到勻漿的效果。經(jīng)常的做法是將組織切在3－5μm薄片，使每一細(xì)胞都被切開但是，我們認(rèn)為切片太薄，容易對過多地將DNA切斷，影響高分子DNA的獲得率。最好是采用15－20μm的厚切片，高濃度蛋白酶K消2－4天，使能達(dá)到細(xì)胞充分破碎、蛋白肖化的目的。并盡可能避免機(jī)械性勻漿過程造成的DNA剪切。此外，在DNA釋放出來以后的提取過程中，應(yīng)盡可能輕柔操作，避免過多地移管。若必需移管時應(yīng)選用大口吸管。盡可能避免人為的DNA剪切。純化DNA用TE（pH8.0）溶解放4℃保存即可，若短其不用時應(yīng)-20℃凍存，但切忌反復(fù)凍融，以免DNA降解。