生物傳感器

　　用固定化生物成分或生物體作為敏感元件的傳感器稱為生物傳感器（biosensor）。生物傳感器并不專指用于生物技術(shù)領(lǐng)域的傳感器，它的應(yīng)用領(lǐng)域還包括環(huán)境監(jiān)測、醫(yī)療衛(wèi)生和食品檢驗等。

　　1．根據(jù)生物傳感器中分子識別元件即敏感元件可分為五類：酶傳感器（enzymesensor），微生物傳感器（microbial sensor），細胞傳感器（organall sensor），組織傳感器（tis-sue sensor）和免疫傳感器（immunol sensor）。顯而易見，所應(yīng)用的敏感材料依次為酶、微生物個體、細胞器、動植物組織、抗原和抗體。

　　2．根據(jù)生物傳感器的換能器即信號轉(zhuǎn)換器分類有：生物電極（bioelectrode）傳感器，半導(dǎo)體生物傳感器（semiconduct biosensor），光生物傳感器（optical biosensor），熱生物傳感器（calorimetric biosensor），壓電晶體生物傳感器（piezoelectric biosensor）等，換能器依次為電化學(xué)電極、半導(dǎo)體、光電轉(zhuǎn)換器、熱敏電阻、壓電晶體等。

　　3．以被測目標(biāo)與分子識別元件的相互作用方式進行分類有生物親合型生物傳感器（affinity biosensor）。

　　生物體中能夠選擇性地分辯特定物質(zhì)的物質(zhì)有酶、抗體、組織、細胞等。這些分子識別功能物質(zhì)通過識別過程可與被測目標(biāo)結(jié)合成復(fù)合物，如抗體和抗原的結(jié)合，酶與基質(zhì)的結(jié)合。在設(shè)計生物傳感器時，選擇適合于測定對象的識別功能物質(zhì)，是極為重要的前提。要考慮到所產(chǎn)生的復(fù)合物的特性。根據(jù)分子識別功能物質(zhì)制備的敏感元件所引起的化學(xué)變化或物理變化，去選擇換能器，是研制高質(zhì)量生物傳感器的另一重要環(huán)節(jié)。敏感元件中光、熱、化學(xué)物質(zhì)的生成或消耗等會產(chǎn)生相應(yīng)的變化量。根據(jù)這些變化量，可以選擇適當(dāng)?shù)膿Q能器。

　　（一）BOD生物傳感器

　　BOD標(biāo)準(zhǔn)稀釋法是水體有機污染的常規(guī)監(jiān)測方法之一。它需要將含有微生物的水樣在20℃培養(yǎng)5d，需要熟練的操作技巧，操作過程繁瑣，不能及時反映水質(zhì)情況。為了簡單、決速地測定BOD，產(chǎn)生了BOD生物傳感器，以代替標(biāo)準(zhǔn)稀釋法。

　　BOD生物傳感器使用的微生物可以是絲孢酵母（Trichosporon cutaneum）。菌體吸附在多孔膜上，室溫下干燥后保存待用。將帶有菌體的多孔膜置于氧電極的Teflon膜上，使菌體處于兩層膜之間。測量系統(tǒng)包括：帶有夾套的流通池（直徑1.7cm，高0.6cm，體積1.4ml），生物傳感器探頭安裝在流通池內(nèi)；蠕動泵；自動采樣器和記錄儀。

　　流通池夾套中水溫恒定于30℃±0.2℃，向流通池中注入氧飽和的磷酸鹽緩沖液（pH7.0，0.1mol/L），流量為1ml/min。電流顯示達穩(wěn)態(tài)值后，以0.2ml/min的流量向流通池注入樣品溶液，每隔60min注入樣品一次。

　　將含有葡萄糖和谷氨酸的標(biāo)準(zhǔn)BOD樣品溶液注入測量系統(tǒng)時，這些有機化合物透過多孔性膜被固定化的微生物所利用。固定化微生物開始消耗氧，引起膜附近溶液的溶解氧含量減少。結(jié)果，氧電極輸出電流隨時間明顯減小，18min內(nèi)達到某一穩(wěn)態(tài)值，此時氧分子向膜內(nèi)的擴散和細胞呼吸之間建立了新的耗氧與供氧的動力學(xué)平衡。

　　穩(wěn)態(tài)電流值的大小取決于樣品溶液的BOD濃度。樣品溶液流過之后，再將緩沖液通入流通池使傳感器的輸出電流值恢復(fù)到初始水平。生物傳感器的響應(yīng)時間（達到穩(wěn)態(tài)電流所需的時間）視樣品溶液的種類而異。對含有乙酸的樣品溶液，響應(yīng)時間為8min；對含有葡萄糖的樣品溶液，響應(yīng)時間為18min。因此，實驗中注入樣品的時間采用20min。

　　該生物傳感器的電流差值（初始電流和穩(wěn)態(tài)電流之差）與五天標(biāo)準(zhǔn)稀釋法測得的BOD濃度之間呈線性關(guān)系。BOD檢測濃度最低限值為3mg/L。在BOD含量為40mg/L時，10次實驗中電流差值可以重現(xiàn)（相對誤差在±6％以內(nèi)）。

　　由固定化硝化細菌、聚四氟乙稀透氣膜和氧電極所構(gòu)成的生物傳感器可用于氨的測定。從活性污泥中分離到的硝化細菌，包括亞硝化單胞菌（Nitrosomonas sp．）和硝化桿菌（Ni-trobacter sp．）被吸附固定在多孔膜上（孔徑0.45μm，厚度150μm），把這種載菌膜裝在氧電極端部，再在菌膜上覆蓋一層透氣膜就制成了氨生物傳感器，硝化細菌以氨為唯一能源消耗氧。

　　氨的濃度可通過檢測氧電極上的固定化微生物的耗氧量來測定。測定在pH9.0，溫度30℃下進行。電流降低值（初始電流值與穩(wěn)態(tài)電流值之差）與氨濃度之間呈線性關(guān)系。檢測最大濃度為42mg/L，最大電流降低值是4.7μA，檢測下限為0.1mg/L，（重現(xiàn)性為±5％）。對各種揮發(fā)性物質(zhì)（如醋酸、乙醇、二甲胺、丁胺等）無響應(yīng)，表明傳感器選擇性極好。對33mg/L氨樣品測定，傳感器輸出電流在長達兩周或者1500次以上的測定中幾乎不變。對人尿中氨進行測定，生物傳感器法與氨電極法相關(guān)系數(shù)為0.9，該生物傳感器已用于發(fā)酵廠排出液中氨的測定。

　　帶有固定化硝化細菌的多孔性膜切成圓片并小心地貼在氧電極表面的Teflon膜上，然后再蓋上一層透氣膜（0.5μm孔徑）并用橡膠環(huán)固定好即可制成亞硝酸鹽傳感器探頭，它的測量系統(tǒng)包括：帶夾套的流通池（直徑23mm，高10mm，液體體積1ml），生物傳感器探頭置于其中；蠕動泵；放大器和記錄儀。

　　通過水浴使流通池的溫度保持在30℃±1℃。以1.6ml/min的流量將氧飽和的緩沖液（pH2.0）輸入流通池，待電極電流達到某一穩(wěn)態(tài)值后，以0.4ml/min的流量將樣品溶液送入流通池，歷時2min。

　　樣品溶液（亞硝酸鈉溶液）送入流通池后，在pH2.0的條件下亞硝酸離子轉(zhuǎn)變成二氧化氮，然后二氧化氮通過透氣膜。在硝化細菌層內(nèi)二氧化氮又轉(zhuǎn)變成亞硝酸離子。亞硝酸離子被硝化細菌作為唯一的能源而被代謝。通過氧電極測出細菌膜附近的溶液的溶解氧消耗，由氧電極的電流降低值可以間接測定亞硝酸鹽的濃度。

　　該傳感器的電流隨時間明顯地減小，直到某一穩(wěn)態(tài)值。10min之內(nèi)可得到穩(wěn)態(tài)電流。

　　初始電流與穩(wěn)態(tài)電流之差和亞硝酸鹽的濃度（在59mmol/L以下）之間呈線性關(guān)系。亞硝酸鹽的最低檢測濃度為0.1mmol/L。用0.25mmol/L的亞硝酸鈉溶液測定時，25次實驗的標(biāo)準(zhǔn)偏差是0.01mmol/L，相對誤差±4％。

　　溶液中含有各種不同的物質(zhì)并不影響到這種生物傳感器的測量效果。同一濃度樣品，在21d內(nèi)經(jīng)400次以上重復(fù)測定，傳感器的電流輸出幾乎不變。

　　將350單位的乙醇氧化酶和1ml5％（V/V）的聚乙烯亞胺及3mg牛血清白蛋白溶液混合，并加入0.2ml 15％（V/V）的戊二醛溶液。在5℃存放4h。再將這種酶的混合物包在聚碳酸脂膜和醋酸纖維素膜之間，并在5℃風(fēng)干24h。這些膜再用0.02％（V/V）的戊二醛溶液處理，并用磷酸鹽緩沖液（0.05mol/L，pH 7.0）洗滌之后，獲得該傳感器的探頭。它的測量系統(tǒng)主要包括：帶夾套的流通池、蠕動泵、自動進樣器、放大器和記錄儀。

　　在0～3.0％（V/V）濃度范圍內(nèi)觀測到的電流增加值和乙醇濃度呈線性關(guān)系。但在3.0％（V/V）濃度以上，是呈非線性的。

　　制備此傳感器所用細菌是甲基單胞菌（Methylomonas）。

　　測量系統(tǒng)包括兩個氧電極、兩個反應(yīng)器、一個電流放大器、兩臺真空泵和一個記錄儀，兩反應(yīng)器容積均為55ml，各含41ml培養(yǎng)液。一個反應(yīng)器載有細菌細胞，另一個反應(yīng)器中沒有細菌細胞。把兩支氧電極分別安裝在兩個測量池中，用玻璃管或聚四氟乙烯管把測量池與整個系統(tǒng)連接起來。一個真空泵的用途是抽空管中的氣體，另一個泵的作用是向系統(tǒng)中輸送氣體樣品。整個系統(tǒng)保持嚴密性，不漏氣，設(shè)計線路保持測量線路和參比線路的對稱性。反應(yīng)池外用恒溫水浴控制在30℃±0.1℃。

　　此傳感器系統(tǒng)在甲烷濃度為0～6.6mmol/L范圍內(nèi)與電流差值有良好的線性關(guān)系，電流差值變化范圍是0～3.5μA，可檢測的最低濃度是5μmol/L，測定0.66mmol/L的樣品（25個）時，電流差值的重現(xiàn)性在5％以內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)偏差是9.40nA。測定甲烷的響應(yīng)時間在60sec內(nèi)恢復(fù)到最初的平衡值，因此，測定一個樣品的總時間是2min。

　　生物化學(xué)反應(yīng)過程產(chǎn)生的信息是多元化的，微電子學(xué)和現(xiàn)代傳感技術(shù)的成果已為檢測這些信息提供了豐富的手段。