酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme－linked immunosorbent assay，ELISA）是免疫酶一種，是一項(xiàng)先進(jìn)的免疫化學(xué)測(cè)定技術(shù)。因其具有特異性高、敏感性強(qiáng)、結(jié)果易于檢測(cè)，是飼料安全檢測(cè)中某些違禁藥品和添加劑，有害微生物的篩檢和毒素的檢測(cè)，是飼料安全檢測(cè)中一項(xiàng)新的檢測(cè)技術(shù)。
1 ELISA 的基本原理及方法類型
1.1 基本原理 EILSA主要是基于抗原或抗體能吸附至固相載體的表面并保持其免疫活性，抗原或抗體與酶形成的酶結(jié)合物仍保持其免疫活性和酶催化活性的基本原理。在測(cè)定時(shí)，把受檢標(biāo)本（測(cè)定其中的抗體或抗原）和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)，用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其它物質(zhì)分開(kāi)，最后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量有一定的比例，加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺進(jìn)行定性或定量分析。
1.2方法類型 ELISA 既可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體。在這種測(cè)定方法中有三個(gè)必要的試劑和五種常見(jiàn)的檢測(cè)方法。
1.2.l 三個(gè)必要的試劑 固相的抗原或抗體；酶標(biāo)記的抗原或抗體；酶反應(yīng)的底物。五種常見(jiàn)的檢測(cè)方法 根據(jù)試劑的來(lái)源和樣品的性狀及檢測(cè)的具體條件，可分為：雙抗體夾心法，主要用于檢測(cè)抗原；間接法，主要用于檢測(cè)抗體；競(jìng)爭(zhēng)法，既可用于檢測(cè)抗原又可用于檢測(cè)抗體；雙抗原夾心法，用已知抗原檢測(cè)未知抗體；中和法，檢測(cè)抗體。
2 ELISA在飼料安全檢測(cè)中的應(yīng)用
飼料安全檢測(cè)需要在各種各樣復(fù)雜基質(zhì)的檢樣中對(duì)含量非常低的有毒害物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)、定量和鑒定，由于飼料產(chǎn)品本身具有的附加值低，流通快，數(shù)量大的特點(diǎn)，因此利用快速、便捷、價(jià)廉、準(zhǔn)確的檢測(cè)手段進(jìn)行飼料安全檢測(cè)極為重要。目前在飼料安全檢測(cè)中通常采用初篩（提供某種有害物質(zhì)是否存在的初步信息）——檢測(cè)（即進(jìn)行分離和定量分析）——確認(rèn)分析（對(duì)有疑問(wèn)的有害物質(zhì)提供明確的鑒定）程序來(lái)監(jiān)測(cè)飼料中的有毒有害物質(zhì)。ELISA因其具有的比傳統(tǒng)的檢測(cè)方法靈敏度高、易于使用、較低的設(shè)備費(fèi)用、快速等優(yōu)點(diǎn)，已越來(lái)越廣泛地應(yīng)用于飼料中違禁藥品和添加劑的
初篩，毒素的測(cè)定，和有害微生物的快速篩檢。
2.1 EllSA用于飼料中違禁藥物和添加劑的初篩2001年12月21日國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局推薦英國(guó)Randox公司生產(chǎn)的ELISA試劑盒為我國(guó)檢測(cè)動(dòng)物激素和抗生素殘留的首選篩選試劑。目前用于飼料中違禁藥品和添加劑篩檢的商品化試劑盒有許多，例如德國(guó)r-Biopharm公司，意大利Tecna及美國(guó)Idexx公司的產(chǎn)品等，它們?cè)陲暳习踩珯z測(cè)中發(fā)揮著重要的作用。本文僅以ELISA試劑盒篩檢鹽酸克倫特羅為例做一介紹。
鹽酸克倫特羅簡(jiǎn)稱克倫特羅（CL），因其對(duì)人類健康的極大危害，被嚴(yán)格禁止在飼料中添加。目前ELISA試劑盒已廣泛用于飼料中克倫特羅的初篩。其基本原理是抗原體反應(yīng)。即利用樣品中的克倫特羅能與酶偶聯(lián)克倫特羅競(jìng)爭(zhēng)性地與固相上已包被的克倫特羅結(jié)合。其基本步驟首先將克倫特羅抗體加入已包被克倫特羅抗體（羊抗兔IgG）的微孔板內(nèi)，經(jīng)過(guò)孵育和洗滌，加入克倫特羅酶標(biāo)記物和待測(cè)樣品，樣品中的克倫特羅與克倫特羅酶標(biāo)記物競(jìng)爭(zhēng)克倫特羅抗體，洗滌除去沒(méi)有連接的克倫特羅酶標(biāo)記物，將酶基質(zhì)和發(fā)色劑加入到孔中并孵育，結(jié)合的酶標(biāo)記物將無(wú)色的發(fā)色劑轉(zhuǎn)為藍(lán)色的產(chǎn)物，再加入反應(yīng)停止液后，使顏色由藍(lán)轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色，在450mm處測(cè)量，吸光度與樣品中鹽酸克倫特羅的濃度成反比。
2.2 ELISA用于飼料中毒素的測(cè)定
飼料中的毒素主要是由真菌產(chǎn)生的，主要包括黃曲霉毒素，簡(jiǎn)曲霉毒素等。運(yùn)用ELISA能測(cè)定飼料中霉菌毒素的含量。以測(cè)定黃曲霉毒素為例，黃曲霉毒素是一組化學(xué)結(jié)構(gòu)類似的化合物，目前已分離鑒定出12種。在我國(guó)飼料標(biāo)準(zhǔn)中黃曲霉毒素的含量通常以黃曲酶毒素B1計(jì)，本文僅介紹競(jìng)爭(zhēng)性ELISA間接法檢測(cè)黃曲霉毒素B1。目前ELISA試劑盒也廣泛用于飼料中黃曲霉毒素B1的測(cè)定。B1抗原能與黃曲霉毒素B1與載體蛋白的復(fù)合物競(jìng)爭(zhēng)抗黃曲霉毒素B1的特異性單克隆抗體，在固相載體表面形成抗原抗體復(fù)合物、復(fù)合物再與現(xiàn)標(biāo)記的第二抗體結(jié)合，在酶的作用下，底物發(fā)生降解而產(chǎn)生有色物質(zhì)，通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定而計(jì)算出樣品中黃曲霉毒素B1的含量。其基本步驟首先用包被抗原包被酶標(biāo)微孔板，洗滌去除未包被抗原，在微孔內(nèi)加入系列標(biāo)準(zhǔn)黃曲霉毒素B1溶液（制作標(biāo)準(zhǔn)曲線）或樣品提取液，再加人稀釋抗體，孵育，洗滌，在微孔內(nèi)加入酶標(biāo)二抗，孵育，洗滌，微孔內(nèi)加入酶底物溶液，孵育，加中止液中止反應(yīng)，測(cè)量、計(jì)算出樣品中黃曲霉毒素B1濃度。
2.3 ELISA用于飼料中有害微生物的快速篩檢 飼料中常含有許多有害微生物，這些有害微生物不僅降低飼料品質(zhì)，影響畜禽的健康，同時(shí)作為一種內(nèi)源性污染，通過(guò)畜產(chǎn)品危及人類。目前飼料安全檢測(cè)中對(duì)飼料中有害微生物的控制主要是監(jiān)測(cè)飼料中沙門氏菌。傳統(tǒng)的沙門氏菌檢測(cè)方法程序復(fù)雜，所用試劑繁雜、檢測(cè)周期長(zhǎng)達(dá)七天，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能適應(yīng)要求。目前已有許多ELISA試劑盒能方便、快速地篩檢出飼料中沙門氏菌的陽(yáng)性樣品。據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，對(duì)一些食品（包括自然污染了沙門氏菌和為了對(duì)比人為加入少量沙門氏菌（0.04－0.2cfu／mL腸炎沙門氏菌）的食品用Salmonella-Tek試劑盒進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果與用常規(guī)培養(yǎng)方法進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果進(jìn)行比較，兩種結(jié)果具有完全的一致性。但由于沙門氏菌與某些菌株之間存在相同的抗原，因此ELISA都是用于沙門氏菌的篩檢，而非確證試驗(yàn)。
用ELISA篩檢沙門氏菌，根據(jù)其采用抗體分為多克隆酶和單克隆酶免疫分析篩選方法。其基本原理是利用與沙門氏菌抗原具有高特異性的單克�。ɑ蚨嗫寺。┛贵w來(lái)檢測(cè)沙門氏菌。其基本步驟是首先在包被有抗沙門氏菌的單克隆抗體（或吸附有沙門氏菌多克隆抗體）的微孔內(nèi)加入經(jīng)過(guò)前增菌和選擇性增菌的待檢樣品，樣品中如有沙門氏菌抗原存在，與孔內(nèi)的特異性抗體結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物，洗滌去掉小孔內(nèi)其它物質(zhì)，加入接合劑，接合劑與抗原抗體結(jié)合物中的抗原結(jié)合，洗滌去掉未結(jié)合的接合劑，加入酶底物，沙門氏菌抗原顯色，再用終止液中止反應(yīng)，測(cè)定光密度值，當(dāng)光密度值大于或等于臨界值時(shí)，即可推定為陽(yáng)性。
3 ELISA社駐的條件實(shí)求
由于ELISA檢測(cè)范圍在ng至Pg水平，屬于超微量分析技術(shù)，因此對(duì)試劑、物料及實(shí)驗(yàn)各步驟的反應(yīng)條件和操作都有嚴(yán)格的要求。
3.1 試劑和物料的條件要求 ELISA試驗(yàn)所需的試劑分為主體試劑和輔助性試劑。通常采用的ELISA商品試劑盒中已包括了足夠進(jìn)行96個(gè)測(cè)量的主體試劑和物料，如已包被抗體的微孔板、標(biāo)準(zhǔn)液、酶標(biāo)記物濃縮液、抗體濃縮液、酶基質(zhì)、發(fā)色劑、停止液等。在使用時(shí)須嚴(yán)格按照使用說(shuō)明書進(jìn)行，一次檢驗(yàn)必須使用同一批號(hào)試劑盒內(nèi)的試劑，不能使用超過(guò)有效期的試劑（物料）。對(duì)于未使用完的試劑和微孔板，必須于2℃～8℃密封保存。不能重復(fù)使用微量孔。對(duì)于加緩沖液、洗滌劑、樣本稀釋液等輔助性試劑的制備，應(yīng)最好在臨用時(shí)配制。蒸餾水的質(zhì)量至關(guān)重要，不合格的蒸餾水能使空白值升高，必須使用新鮮的雙蒸餾水來(lái)制備試劑。
3.2 操作步驟的條件要求 開(kāi)始試驗(yàn)前應(yīng)將試劑盒和待測(cè)樣品回至室溫20℃－25℃，每一樣品及試劑均使用單獨(dú)的吸嘴以免交叉污染。在加樣時(shí)應(yīng)力求準(zhǔn)確，將樣品加入孔底，不可出現(xiàn)氣泡。在孵育培養(yǎng)時(shí)，由ELISA試驗(yàn)一般都有二次抗原抗體反應(yīng)，應(yīng)注意使各ELISA條板的溫度迅速平衡，當(dāng)室溫高于20℃，可將ELISA板避光放在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上以便不時(shí)觀測(cè)。在洗滌時(shí)應(yīng)特別仔細(xì)，雖然洗滌在ELISA度試驗(yàn)中不是一個(gè)反應(yīng)步驟，但卻決定著試驗(yàn)的成敗，洗滌的目的是洗去反應(yīng)液中沒(méi)有與固相抗原（體）相結(jié)合的物質(zhì)，以及在反應(yīng)過(guò)程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質(zhì)，如洗滌不徹底，特別是最后一次如有酶結(jié)合物的非特異性吸附存在，將使空白值升高。