植物抗蟲基因工程的研究進展

摘要 概述了目前應(yīng)用于植物抗蟲基因工程的兩類主要基因，即蘇云金桿菌毒蛋白基因和蛋白酶抑制劑基因的分類、殺蟲機理以及基因改造后應(yīng)用于抗蟲基因工程的研究近況，同時探討了抗蟲基因工程存在問題及解決途徑，提出了今后可能的發(fā)展方向。

0、前言

蟲害是制約農(nóng)作物高產(chǎn)的重要因素，世界每年因蟲害造成的損失約占農(nóng)作物總產(chǎn)量的15%以上�；瘜W(xué)農(nóng)藥的施用在減少蟲害的同時引起一系列副作用，如提高成本、污染環(huán)境、誘導(dǎo)害蟲產(chǎn)生抗藥性、引起次要害蟲的大發(fā)生等。而通過基因工程手段培育抗蟲新品種 (系)可從根本上解決問題，對哺乳動物和一些有益昆蟲不產(chǎn)生毒害作用，且不造成環(huán)境污染，具有廣闊的應(yīng)用前景。目前全世界最常改良的性狀中抗蟲占第二位(24%)，到1998年已商業(yè)化的6類性狀中抗蟲占15%，抗蟲和抗除草劑占10%。人們已從細(xì)菌中、植物本身以及昆蟲體內(nèi)發(fā)現(xiàn)并分離到許多抗蟲基因，有許多抗蟲轉(zhuǎn)基因植物正在進行田間試驗，并有一些品種已商品化。迄今發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用于提高植物抗蟲性的基因主要有兩類:一類是從細(xì)菌中分離出來的抗蟲基因，如蘇云金桿菌毒蛋白基因(Bt基因)、異戊基轉(zhuǎn)移酶基因(ipt)，另一類是從植物中分離出來的抗蟲基因，如蛋白酶抑制劑基因(PI基因)、淀粉酶抑制劑基因、外源凝集素基因等。其中Bt基因和PI基因在農(nóng)業(yè)上利用最廣，本文對這兩類基因的轉(zhuǎn)基因工程研究作一簡要綜述。

1、Bt毒蛋白基因

1．l Bt毒蛋白的殺蟲機理

　　Bt是蘇云金桿菌Baciius thuringiensis的簡稱，是一種革蘭氏陽性土壤芽胞桿菌。通過克隆技術(shù)確定Bt基因位于30~150MD大小不同的質(zhì)粒上，其中毒性區(qū)間位于該序列N端29~607個編碼區(qū)，C端有高度的保守性，對穩(wěn)定晶體蛋白結(jié)構(gòu)可能起著重要作用。Bt殺蟲活性源于芽胞形成時產(chǎn)生的殺蟲結(jié)晶蛋白(insecticidal crystal protein，ICP)或蘇云金桿菌毒蛋白(Bt toxic protein)，其中應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要是δ內(nèi)毒素。已知δ內(nèi)毒素為130~160KD的多肽，在伴孢晶體內(nèi)是以原毒素(protoxin)的形式存在，經(jīng)體外堿解或在昆蟲腸道內(nèi)被蛋白酶水解成55~70KD或更小的多肽，與敏感昆蟲中腸道上皮紋緣細(xì)胞 (brushborder membrance)上的特異受體位點結(jié)合，引起并破壞紋緣膜細(xì)胞滲透壓平衡，使細(xì)胞裂解，殺死昆蟲。

1．2 Bt霉蛋白基因分類

自1901年發(fā)現(xiàn)蘇云金桿菌以來，現(xiàn)已分離出4萬多個Bt菌種，報道了51個血清型，50多個亞種，已克隆出60多個毒素基因。不同基因型殺蟲譜不同，毒蛋白的大小及形狀也不一樣。根據(jù)殺蟲譜的不同，將殺蟲基因分成六大類，統(tǒng)稱為cry基因，用羅馬數(shù)字I、II、III、IV等來命名，分別代表幾種殺蟲范圍。在每一類型下根據(jù)氨基酸序列的同源性，又分為A，B，C等不同的基因型。在同一基因型下根據(jù)限制性內(nèi)切酶的酶譜和分子量的大小，又分為a，b，c等不同的基因亞型。其分類如下:

cry I基因型編碼對鱗翅目昆蟲有毒殺作用的菱形伴孢晶體蛋白，約30~140KD，在昆蟲中腸內(nèi)降解為60~70KD的多肽，在cry I基因間，氨基酸同源性為82%~90%的歸為cry I A;55%~71%的歸為cry I A基因中，根據(jù)限制性內(nèi)切酶的酶譜和分子量的大小，又分為:cry I A (a)，4.50kb;cry I A (b)，5.30kb;cry I A (c)，6.60kb亞類基因。Cry II基因通常編碼對鱗翅目和雙翅目昆蟲有毒殺作用的立方體伴孢晶體蛋白，約65KD。而cry II B只對鱗翅目昆蟲有毒性，它們之間的同源性達80%左右。cry III基因編碼對鞘翅目昆蟲有特異毒殺作用的長方形伴孢晶體，約72KD。Cry III A基因與cry I和cryIV基因的毒性核心5' 端編碼區(qū)有同源性，與3'端編碼區(qū)有所不同，如果將3'端去掉，將失去殺蟲活性。Cry IV基因編碼對雙翅

目昆蟲有特異毒性的橢園形伴孢晶體。cry IV A，135KD;cry IV B，128KD;cry IV C，78KD;cry IV D，72KD，cry IV A和cry IV B基因在結(jié)構(gòu)上與cry I相似，毒性核心區(qū)段為53~78KD，位于原毒素蛋白的N端。

1．3 Bt毒蛋白基因的修飾、改造及應(yīng)用

雖然早期的轉(zhuǎn)抗蟲基因植物或多或少都對昆蟲有些抗性，但殺蟲蛋白在植株上的表達量很低 (占全部可溶性蛋白的0.001%以下)，抗蟲效果不理想。其主要原因是目前使用的殺蟲晶體蛋白大多來源于細(xì)菌，與高等植物結(jié)構(gòu)基因正常的DNA序列相比，Bt基因含有較多的AT堿基和ATTTA重復(fù)序列。AT富含區(qū)在高等植物中被認(rèn)為是不能表達的內(nèi)含子，ATTTA重復(fù)序列的mRNA的穩(wěn)定性差，二者都不能在高等植物中編碼。此外，Bt基因中的偏愛密碼子與植物中的不同，以及共中存在的一些不穩(wěn)定元件如poly(A)信號序列、切割序列、終止序列等都直接影響著Bt基因在植物中的mRNA特性。為此，Monsanto公司從兩條途徑對原基因進行了改造。

第一條途徑是改進Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化載體的啟動子，加入帶有SV40復(fù)制增強子區(qū)的35S啟動子或重復(fù)的強化表達區(qū) (duplicated enhanced region)，發(fā)現(xiàn)改建后的載體表達量比原先提高了5~10倍 (Perlak等，1990)。

第二條途徑是根據(jù)植物偏愛的密碼子對野生型(WT)Bt基因cry I A(b)進行部分改造或人工全合成，Perlak等對WT cryIA(b)AT富含區(qū)進行點突變，改變其中63個堿基對，AT含量由63%下降至59%，而ATTTA重復(fù)序列也從13個減少至7個，部分改造后的基因稱為PMcryIA(b)。PMcryIA(b)基因在轉(zhuǎn)化的煙草和番茄中的表達量為1~l0ng/50ug植物可溶總蛋白，比WTcryIA(b)在轉(zhuǎn)基因植物中的表達量(<1ng/50ug)提高了10倍。進一步在不改變編碼的氨基酸序列的前提下，幾乎更換掉WT基因中的所有不穩(wěn)定元件，同時盡可能將其中的密碼子換成植物優(yōu)化密碼子，AT含量下降至51%，去掉所有ATTTA序列。全合成的基因稱為Fncry I A(b)用其轉(zhuǎn)化煙草 番茄，10%以上的轉(zhuǎn)化植株表達量達30-100n/50ug植物可溶總蛋白，最高的可達100－150ng/50ug，比WtcryIA(b)的表達量提高50－100倍，表現(xiàn)較強的殺蟲效果。

近年來人們在Ｂt毒蛋白基因的修飾與改造、表達載體的構(gòu)建、植物組織化、抗蟲植物的培育等方面作了大量工作（Krattiger,1997）。我國也從1991年起開始了Ｂt cry I A殺蟲基因的部分改造或全合成，并導(dǎo)入棉花、煙草、甘藍等25種以上植物獲得成功。目前全世界已獲得50多種不同的抗蟲轉(zhuǎn)基因植物，技術(shù)趨向成熟，成果向商品化、實用化階段深入，并開展大規(guī)模的田間推廣試驗。從1995年起，cry I A 類轉(zhuǎn)基因玉米、棉花和馬鈴薯已商品化，性狀有單基因的抗玉米螟、抗棉鈴蟲和抗馬鈴薯甲蟲，還有玉米和棉花的多基因抗蟲＋抗除草劑必狀（表1）。

表1 轉(zhuǎn)Bt基因植物

2、蛋白酶抑制劑基因（PI基因）

PI是自然界最為豐富的蛋白質(zhì)之一，存在于絕大多數(shù)生物體尤其是許多植物的貯藏器官，如種子和塊莖中，是一類天然的抗蟲物質(zhì)，與前述蘇云金桿菌相比，具有抗蟲譜廣、對人畜無副作用及昆蟲不易產(chǎn)生耐受性等優(yōu)點（Gatehouse,1988）。在植物界，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)近10個蛋白酶抑制劑家族，與抗蟲基因工程關(guān)系最密切、研究最深入的是絲氨酸蛋白酶抑制劑，基中最主要的是胰蛋白酶抑制劑。因為絕大多數(shù)昆蟲所利用的正是這一類消化酶，而植物細(xì)胞基本沒有這種酶，或含量甚微。PI同昆蟲消化道內(nèi)的蛋白消化酶形成復(fù)合物，阻斷或削弱蛋白酶的水解形成復(fù)合物，阻斷或削弱蛋白酶的水解作用，使昆蟲厭食或消化不良致死，從而達到抗蟲目的。

目前已從豇豆、馬鈴薯、番茄、大豆、玉米等植物中分離純化出多種蛋白酶抑制劑基因或cDNA克隆。主要有豇豆胰蛋白酶抑制劑基因（CpTI基因）、馬鈴薯胰蛋白酶抑制劑基因（PTI基因）、玉米半胱氨酸蛋白酶抑制劑基因（CPI基因）以及大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制劑基因（SKTI基因）等。比較不同來源的各種蛋白酶抑制劑，發(fā)現(xiàn)CpTI抗蟲效果較為理想，其抗蟲范圍廣，對鱗翅目、鞘翅目、直翅目等幾乎所有昆蟲都有殺傷作用，而且其作用位點在酶的活性中心，突變的可能性小，昆蟲產(chǎn)生抗性突變的可能性幾乎沒有，目前已應(yīng)用于抗蟲煙草、水稻、大豆，但由于其表達能力不夠強，應(yīng)用暫時受到限制。1997年高越峰、朱禎等人從未成熟的大豆子葉中分離出SKTI基因，為多基因家族，可抑制不同來源的胰蛋白酶活性，尤其對鱗翅目昆蟲有較強抑制作用，且SKTI對胰蛋白酶活性的抑制能力明顯高于CpTI，顯示出較好的應(yīng)用前景。表2列出蛋白酶抑制劑基因主要應(yīng)用實例。

表2 轉(zhuǎn)蛋白酶抑制劑基因植物

3、抗蟲基因工程潛在的問題、解決途徑及展望

伴隨抗蟲基因工程進展，其在應(yīng)用方面潛在的問題也日益顯露。

首先是昆蟲對Bt毒蛋白產(chǎn)生抗性的問題。原因之一：根據(jù)Bt毒蛋白的殺蟲機理，在長期選擇壓力下，昆蟲紋緣膜細(xì)胞上的受體位點會發(fā)生改變，使晶體蛋白不能與紋緣膜細(xì)胞上的受體位點結(jié)合，失去毒殺作用，結(jié)果昆蟲就產(chǎn)生抗生。為此，可以采取以下策略，(1)將不同殺蟲機理的殺蟲蛋白基因;如具有廣譜抗蟲特點的CpTI基因以及其他多肽毒素基因結(jié)合Bt基因轉(zhuǎn)化植物來抑制昆蟲產(chǎn)生抗性。(2)采用誘導(dǎo)型或組織特異性表達的啟動子與Bt毒蛋白基因構(gòu)成嵌合基因，獲得特異性表達的抗蟲品種。使Bt基因只在害蟲侵害時或者只在植物易受害蟲侵害的部位或者只在一定的條件下 (如化學(xué)調(diào)節(jié)劑)高效表達，以減少耐受性昆蟲 的發(fā)展。(3)把高劑量表達的轉(zhuǎn)基因植物與非轉(zhuǎn)基因植物混合播種，使在Bt植株上具有純合抗性基因的抗性昆蟲與非轉(zhuǎn)基因植物內(nèi)易感昆蟲交配，它們的后代成為雜合體，這樣可以去除昆蟲產(chǎn)生的抗性基因，防止抗性等位基因在昆蟲群體中固定。原因之二：Bt毒蛋白的抗蟲譜較窄，某一特定的毒蛋白只對某一種或幾種害蟲具有毒殺作用，害蟲易對其產(chǎn)生抗性。對此可同時使用兩個以上的Bt毒蛋白基因轉(zhuǎn)化植物。不同的Bt毒蛋白，根據(jù)與竺定昆蟲中腸紋緣膜細(xì)胞不同受體位點的結(jié)合程度，分為競爭性結(jié)合 (competitively binding)和非競爭性結(jié)合 (noncompetitively binding)蛋白，如果兩種晶體蛋白競爭結(jié)合昆蟲中腸全部受體位點，就稱為競爭性結(jié)合毒蛋白;如果與第一種毒蛋白結(jié)合的受體中有一個或多個不為第二種蛋白所競爭，反之亦然，那么，對該昆蟲來說，這兩上毒蛋白都是非競爭的。將編碼非競爭性結(jié)合毒蛋白的2個或2個以上基因同時導(dǎo)入植物，能在很大程度上延緩害蟲所產(chǎn)生的抗性。

第二個問題是目前Bt毒蛋白基因在轉(zhuǎn)基因植物體中的表達水平普遍較低，存在基因“沉默”和甲基化現(xiàn)象，不能有效地毒殺害蟲。基因沉默與目的基因在受體植物中的甲基化狀況、拷貝數(shù)、插入受體染色體位點及是否與受體植物中有同源基因等因素有關(guān)。目前主要采取以下措施來克服基因沉默現(xiàn)象；(1)避免多拷貝外源基因整合到受體基因組中，如利用Ac/Ds轉(zhuǎn)化載體、雙元細(xì)菌人造染色體載體、構(gòu)建核基質(zhì)支架附著區(qū)載體系統(tǒng)。(2)用具有特殊功能的啟動子與增強子調(diào)控。(3)在有性世代后代中篩選單拷貝轉(zhuǎn)基因個體。（4）繼續(xù)深入研究DNA的空間結(jié)構(gòu)以及各種調(diào)控因子和環(huán)境因子對轉(zhuǎn)基因的影響。Jaquet等分析至少有三種因素影響殺蟲活性:毒素的來源、晶體的溶解性和昆蟲對毒素的內(nèi)在敏感性，昆蟲對毒素的 內(nèi)在敏感性至少還與中腸液pH、蛋白酶活性和毒素受體的類型、數(shù)量有關(guān)。Bt毒蛋白有134個亞類，它們一級結(jié)構(gòu)的差異以及昆蟲中腸上皮細(xì)胞上的受體是影響殺蟲晶體蛋白毒力和殺蟲特異性的兩個重要因素。隨著轉(zhuǎn)基因沉默機理研究的不斷深入，這種現(xiàn)象最終必將會得到克服。

抗蟲植物基因工程是一項應(yīng)用性極強的研究，它使短時間內(nèi)培育出抗蟲品種成為可能。同時正在進行田間試驗的性狀中，多基因抗蟲性狀也屢次出現(xiàn)，將Bt基因、特殊的抗病基因、抗除草劑基因及優(yōu)良品質(zhì)基因集聚于同一品種。相信不久的將來，會有越來越多的多基因抗蟲品種問世。