免疫膠體金(Immune colloidal gold)

原理

免疫膠體金技術(shù)是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物應(yīng)用于抗原抗體的一種新型的免疫標(biāo)記技術(shù)。膠體金是由氯金酸（HAuCl₄）在還原劑如白磷、抗壞血酸、枸櫞酸鈉、鞣酸等作用下，聚合成為特定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，稱為膠體金。膠體金在弱堿環(huán)境下帶負(fù)電荷，可與蛋白質(zhì)分子的正電荷基團(tuán)形成牢固的結(jié)合，由于這種結(jié)合是靜電結(jié)合，所以不影響蛋白質(zhì)的生物特性。

膠體金除了與蛋白質(zhì)結(jié)合以外，還可以與許多其它生物大分子結(jié)合，如SPA、PHA、ConA等。根據(jù)膠體金的一些物理性狀，如高電子密度、顆粒大小、形狀及顏色反應(yīng)，加上結(jié)合物的免疫和生物學(xué)特性，因而使膠體金廣泛地應(yīng)用于免疫學(xué)、組織學(xué)、病理學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)等領(lǐng)域。

膠體金的制備

根據(jù)不同的還原劑可以制備大小不同的膠體金顆粒。常用來制備膠體金顆粒的方法如下。

1．枸櫞酸三鈉還原法

（1）10nm膠體金粒的制備：取0.01％HAuCl₄水溶液100ml，加入1％枸櫞酸三鈉水溶液3ml，加熱煮沸30min，冷卻至4℃，溶液呈紅色。

（2）15nm膠體金顆粒的制備：取0.01％HAuCl₄水溶液100ml，加入1％枸櫞酸三鈉水溶液2ml，加熱煮沸15min～30min，直至顏色變紅。冷卻后加入0.1Mol/L K₂CO₃0.5ml，混勻即可。

（3）15nm、18nm～20nm、30nm或50nm膠體金顆粒的制備：取0.01％HAuCl₄水溶液100ml，加熱煮沸。根據(jù)需要迅速加入1％枸櫞酸三鈉水溶液4ml、2.5ml、1ml或0.75ml，繼續(xù)煮沸約5min，出現(xiàn)橙紅色。這樣制成的膠體金顆粒則分別為15nm、18～20nm、30nm和50nm。

2．鞣酸—枸櫞酸鈉還原法

A液：1％HAuCl₄水溶液1ml加入79ml雙餾水中混勻。

B液：1％枸櫞酸三鈉4ml，1％鞣酸0.7ml，0.1Mol/L K₂CO₃液0.2ml，混合，加入雙餾水至20ml。

將A液、B液分別加熱至60℃，在電磁攪拌下迅速將B液加入A液中，溶液變藍(lán)，繼續(xù)加熱攪拌至溶液變成亮紅色。此法制得的金顆粒的直徑為5nm。如需要制備其它直徑的金顆粒，則按表所列的數(shù)字調(diào)整鞣酸及K₂CO₃的用量。

鞣酸—枸櫞酸鈉還原法試劑配制表

3．制備高質(zhì)量膠體金的注意事項(xiàng)

（1）玻璃器皿必須徹底清洗，最好是經(jīng)過硅化處理的玻璃器皿，或用第一次配制的膠體金穩(wěn)定的玻璃器皿，再用雙餾水沖洗后使用。否則影響生物大分子與金顆粒結(jié)合和活化后金顆粒的穩(wěn)定性，不能獲得預(yù)期大小的金顆粒。

（2）試劑配制必須保持嚴(yán)格的純凈，所有試劑都必須使用雙餾水或三餾水并去離子后配制，或者在臨用前將配好的試劑經(jīng)超濾或微孔濾膜（0.45µm）過濾，以除去其中的聚合物和其它可能混入的雜質(zhì)。

（3）配制膠體金溶液的pH以中性（pH7.2）較好。

（4）氯金酸的質(zhì)量要求上乘，雜質(zhì)少。最好是進(jìn)口的。

（5）氯金酸配成1％水溶液在4℃可保持?jǐn)?shù)月穩(wěn)定，由于氯金酸易潮解，因此在配制時(shí)，最好將整個(gè)小包裝一次性溶解。

膠體金標(biāo)記蛋白的制備

膠體金對(duì)蛋白的吸附主要取決于pH值，在接近蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)或偏堿的條件下，二者容易形成牢固的結(jié)合物。如果膠體金的pH值低于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí)，則會(huì)聚集而失去結(jié)合能力。除此以外膠體金顆粒的大小、離子強(qiáng)度、蛋白質(zhì)的分子量等都影響膠體金與蛋白質(zhì)的結(jié)合。

1．待標(biāo)記蛋白溶液的制備 將待標(biāo)記蛋白預(yù)先對(duì)0.005Mol/L pH7.0 NaCl溶液中4℃透析過夜，以除去多余的鹽離子，然后100 000g4℃離心1h，去除聚合物。

2．待標(biāo)膠體金溶液的準(zhǔn)備 以0.1Mol/L K₂CO₃或0.1Mol/L HCl調(diào)膠體金液的pH值。標(biāo)記IgG時(shí)，調(diào)至9.0；標(biāo)記McAb時(shí),調(diào)至8.2；標(biāo)記親和層析抗體時(shí)，調(diào)至7.6；標(biāo)記SPA時(shí)，調(diào)至5.9～6.2；標(biāo)記ConA時(shí)，調(diào)至8.0；標(biāo)記親和素時(shí)，調(diào)至9～10。

由于膠體金溶液可能損壞pH計(jì)的電板，因此，在調(diào)節(jié)pH時(shí)，采用精密pH試紙測(cè)定為宜。

3．膠體金與標(biāo)記蛋白用量之比的確定

（1）根據(jù)待標(biāo)記蛋白的要求，將膠體金調(diào)好pH之后，分裝10管，每管1ml。

（2）將標(biāo)記蛋白（以IgG為例）以0.005Mol/L pH9.0硼酸鹽緩沖液做系列稀釋為5µg/ml～50µg/ml，分別取1ml，加入上列金膠溶液中，混勻。對(duì)照管只加1ml稀釋液。

（3）5min后，在上述各管中加入0.1ml 10％NaCl溶液，混勻后靜置2h，觀察結(jié)果。

（4）結(jié)果觀察，對(duì)照管（未加蛋白質(zhì)）和加入蛋白質(zhì)的量不足以穩(wěn)定膠體金的各管，均呈現(xiàn)出由紅變藍(lán)的聚沉現(xiàn)象；而加入蛋白量達(dá)到或超過最低穩(wěn)定量的各管仍保持紅色不變。以穩(wěn)定1ml膠體金溶液紅色不變的最低蛋白質(zhì)用量，即為該標(biāo)記蛋白質(zhì)的最低用量，在實(shí)際工作中，可適當(dāng)增加10％～20％。

4．膠體金與蛋白質(zhì)（IgG）的結(jié)合 將膠體金和IgG溶液分別以0.1Mol/L K₂CO₃調(diào)pH至9.0，電磁攪拌IgG溶液，加入膠體金溶液，繼續(xù)攪拌10min，加入一定量的穩(wěn)定劑以防止抗體蛋白與膠體金聚合發(fā)生沉淀。常用穩(wěn)定劑是5％胎牛血清（BSA）和1％聚乙二醇（分子量20KD）。加入的量：5％BSA使溶液終濃度為1％；1％聚乙二醇加至總?cè)芤旱?/span>1／10。

5．膠體金標(biāo)記蛋白的純化

（1）超速離心法：根據(jù)膠體金顆粒的大小，標(biāo)記蛋白的種類及穩(wěn)定劑的不同選用不同的離心速度和離心時(shí)間。

用BSA做穩(wěn)定劑的膠體金—羊抗兔IgG結(jié)合物可先低速離心（20nm金膠粒用1 200r/min，5nm金膠粒用1 800r/min）20min，棄去凝聚的沉淀。然后將5nm膠體金結(jié)合物用6 000g，4℃離心1h；20nm～40nm膠體金結(jié)合物，14 000g，4℃離心1h。仔細(xì)吸出上清，沉淀物用含1％BSA的PB液（含0.02％NaN₃），將沉淀重懸為原體積的1／10，4℃保存。如在結(jié)合物內(nèi)加50％甘油可貯存于-18℃保存一年以上。

為了得到顆粒均一的免疫金試劑，可將上述初步純化的結(jié)合物再進(jìn)一步用10％～30％蔗糖或甘油進(jìn)行密度梯度離心,分帶收集不同梯度的膠體金與蛋白的結(jié)合物。

（2）凝膠過濾法：此法只適用于以BSA作穩(wěn)定劑的膠體金蛋白結(jié)合物的純化。將膠體金蛋白結(jié)合物裝入透析袋，在硅膠中脫水濃縮至原體積的1／5～1／10。再經(jīng)1 500r/min離心20min。取上清加至Sephacryl S-400（丙烯葡聚糖凝膠S-400）層析柱分別純化。層析柱為0.8 cm×20cm，加樣量為床體積的1／10，以0.02Mol/L PBS液洗脫（內(nèi)含0.1％BSA，0.05％NaN₃，pH8.2者用IgG標(biāo)記物），流速為8ml/h。按紅色深淺分管收集洗脫液。一般先濾出的液體為微黃色，有時(shí)略混濁，內(nèi)含大顆粒聚合物等雜質(zhì)。繼之為純化的膠體金蛋白結(jié)合物，隨濃度的增加而紅色逐漸加深，清亮透明，最后洗脫出略帶黃色的為標(biāo)記的蛋白組分。將純化的膠體金蛋白結(jié)合物過濾除菌、分裝,4℃保存。最終可得到70％～80％的產(chǎn)量。

6．膠體金蛋白結(jié)合物的質(zhì)量鑒定

（1）膠體金顆粒平均直徑的測(cè)量：用支持膜的鎳網(wǎng)（銅網(wǎng)也可）蘸取金標(biāo)蛋白試劑，自然干燥后直接在透射電鏡下觀察。或用醋酸鈾復(fù)染后觀察。計(jì)算100個(gè)金顆粒的平均直徑。

（2）膠體金溶液的OD₅₂₀nm值測(cè)定：膠體金顆粒在波長(zhǎng)510nm～550nm之間出現(xiàn)最大吸收值峰。用0.02Mol/L pH8.2 PBS液（含1％BSA，0.02％NaN₃）將膠體金蛋白試劑作1︰20稀釋，OD₅₂₀＝0.25左右。一般應(yīng)用液的OD₅₂₀應(yīng)為0.2～0.4。

（3）金標(biāo)記蛋白的特異性與敏感性測(cè)定：采用微孔濾膜免疫金銀染色法（MF－IGSSA）。將可溶性抗原（或抗體）吸附于載體上（濾紙、硝酸纖維膜、微孔濾膜），用膠體金標(biāo)記的抗體（或抗原）以直接或間接染色法并經(jīng)銀顯影來檢測(cè)相應(yīng)的抗原或抗體，對(duì)金標(biāo)記蛋白的特異性和敏感性進(jìn)行鑒定。