標(biāo)記抗原的放射免疫技術(shù)（ＲIA）

當(dāng)抗原遇到相應(yīng)的抗體便形成抗原抗體復(fù)合物（Ag＋Ab ↔Ag －Ab），當(dāng)用放射性同位素標(biāo)記抗原再與相應(yīng)的抗體結(jié)合便形成標(biāo)記抗原和抗體復(fù)合物。即： Ag Ab↔ Ag－Ab。當(dāng)標(biāo)記抗原和未標(biāo)記抗原一起加入相應(yīng)的抗體時(shí)則兩種抗原產(chǎn)生相互的競(jìng)爭(zhēng)，而生成有標(biāo)記抗原和抗體復(fù)合物以及非標(biāo)記抗原和抗體復(fù)合物。生成標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物與非標(biāo)記抗原的含量在一定的限度內(nèi)是呈反比的，所以利用這個(gè)原理去測(cè)定未知抗原或抗體。

﹡Ag Ag Ab Ag（F）

＋Ab

Ag Ag Ab（B） Ag

如果Ag多則*Ag－Ab（即結(jié)合抗原B）生成量減少，*Ag（即游離抗原F）的剩余量就多。相反，Ag少，則*Ag－Ab生成量就多，*Ag的剩余量就少。通過(guò)檢測(cè)游離抗原F和結(jié)合抗原B，就可知未知抗原的存在與否以及含量的多少。

1、完全抗原 為了保證免疫反應(yīng)的特異性，對(duì)放射免疫抗原要求的純度較高，必須在90%以上。通常采用電泳、凝膠過(guò)濾、離子交換層析等技術(shù)獲得較高純度的抗原。純化的抗原必須經(jīng)過(guò)純度鑒定才能使用。鑒定辦法：通過(guò)電泳只出現(xiàn)一條沉淀線，或者以圓盤電泳進(jìn)行純度分析。

2、半抗原 要獲得較好的免疫原性，必須將半抗原與蛋白質(zhì)大分子的載體結(jié)合起來(lái)形成一個(gè)完全抗原。結(jié)合的載體，通常包括血清白蛋白、 球蛋白、纖維蛋白、甲狀腺球蛋白、雞卵蛋白等。連接方式則因半抗原的功能基團(tuán)與蛋白質(zhì)載體功能基團(tuán)所決定。常用的連接劑有二亞胺、二異氰酸、過(guò)碘酸鹽等。

見(jiàn)第八章免疫球蛋白的制備與提純。

1．放射性同位素的選擇 選擇同位素的原則。

⑴ 定方法簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、便于推廣應(yīng)用。

⑵ 易于防護(hù)。

⑶ 同位素與標(biāo)記物結(jié)合好，不易從標(biāo)記物上脫落。

⑷ 對(duì)標(biāo)記物不引起輻射損傷，使蛋白變性。

⑸ 具有較高的計(jì)數(shù)效率。

目前常用的同位素有³H、¹²⁵ I，其它還有¹⁴C、³⁵S和³²P等。① ³H 因所有的有機(jī)化合物中均含有氫，用³H來(lái)置換氫，不至于影響其原有化合物的化學(xué)性質(zhì)。³H的半衰期長(zhǎng)，是一個(gè)弱 衰變，能量低，便于防護(hù)。一次標(biāo)記可以使用較長(zhǎng)時(shí)間，采用閃爍儀測(cè)量，測(cè)量效力可達(dá)60%。³H標(biāo)記要求條件較高，一般需由專門機(jī)構(gòu)來(lái)承擔(dān)，不易推廣；② ¹²⁵I 碘標(biāo)記的化合物比度高，標(biāo)記方法簡(jiǎn)便，而且標(biāo)記物可在碘化鈉晶體﹟型計(jì)數(shù)器上直接測(cè)定。¹²⁵I發(fā)射 射線，含有酪氨酸的蛋白質(zhì)和多肽均可用放射性I標(biāo)記。目前，連接標(biāo)記技術(shù)已有相當(dāng)發(fā)展，致使許多非蛋白質(zhì)和多肽的半抗原也可以用碘來(lái)標(biāo)記。另外碘的放射能量較大，半衰期也較短。

雖然¹²⁵I的放射比活性僅為¹³¹I的13%，但¹²⁵I的半衰期較¹³¹I長(zhǎng)，同位素豐度大，輻射損傷小，計(jì)數(shù)效率也較高，因此¹²⁵I比¹³¹I更為常用。

表 各種標(biāo)記同位素的性質(zhì)比較

2．標(biāo)記方法 目前常用的是碘標(biāo)記法。碘化標(biāo)記的方法很多，如氯化碘法、乳過(guò)氧化酶法、過(guò)氯酸法和連接標(biāo)記法等。但比較起來(lái)，氯胺T法最為簡(jiǎn)便，效果好，易于采用。

氯胺T碘化標(biāo)記法的原理：氯胺T是一種氧化劑，在水溶液中可以緩慢地釋放次氯酸，因而可以在標(biāo)記的過(guò)程中形成一種能產(chǎn)生溫和氧化效果的中間體，它可使放射性碘離子氧化而呈活潑形式的碘離子，并取代抗原分子中酪氨酸苯環(huán)羥基鄰位的一個(gè)或二個(gè)氫原子，使之成為含有碘化酪氨酸的多肽鏈。其記過(guò)程為：

⑴ 將蛋白質(zhì)抗原以0.5Mol/L pH7.5PB液稀釋為20μg/μl，取5μl~10μl。

⑵ 取Na¹²⁵I 5μl(含2mci~3mci)。

⑶ 將1mg氯胺T溶于0.5Mol/L pH7.5PB液 0.1ml中。

⑷ 再將Na¹²⁵I和氯胺T分別緩緩加入蛋白質(zhì)液中，于冰浴中邊加邊攪拌，加完后再攪拌5min。

⑸ 加0.1ml(含3mg)偏重硫酸鈉(以PB液配制)。

⑹ 再加1%碘化鉀液1滴，看液體是否完全透明。如仍呈棕色，應(yīng)繼續(xù)加少許的偏重硫酸鈉。

⑺ 過(guò)SephadexG50柱，取第一峰，即為碘標(biāo)記的蛋白質(zhì)抗原。

3．標(biāo)記的最佳條件

⑴ 放射性碘比活性要高。

⑵ 反應(yīng)體積要小。

⑶ 標(biāo)記反應(yīng)的pH值，以pH7.5為宜，超過(guò)8.5，碘則取代酪氨酸以外的其它成分。

⑷ 氯胺T的用量必須事先測(cè)定。其方法為定出在標(biāo)記的蛋白質(zhì)存在時(shí)，10%的三氯醋酸能沉淀最大量放射性碘所需要的最小量的氯胺T。氯胺T的用量必須適當(dāng)。用量少，雖能滿足反應(yīng)的要求，但產(chǎn)率低；用量大易使蛋白質(zhì)變性。

⑸ 蛋白質(zhì)的濃度決定碘化的效率。對(duì)含量中等的氯胺酸的蛋白質(zhì)而言，在蛋白質(zhì)濃度為1mg/ml，蛋白質(zhì)的回收率為100%，濃度為300μg/ml，則為80%～90%，當(dāng)濃度降至50μg/ml時(shí)，則回收率只有60%～70%。

4．標(biāo)記物的鑒定

⑴ 放射性化學(xué)純度鑒定是指某一化學(xué)形式的放射性物質(zhì)的放射強(qiáng)度在該樣品中所占放射性總強(qiáng)度的百分比。鑒定方法為：取標(biāo)記的蛋白質(zhì)或多肽抗原液少許，加入1%～2%載體蛋白及等量的15%三氯醋酸，搖勻靜置數(shù)分鐘后，3 000r/min離心15min分別測(cè)上清液(含游離碘)及沉淀(含標(biāo)記抗原)的放射活性。一般要求游離碘含量占總放射性碘的5%以下。標(biāo)記抗原貯藏較久后，仍有部分放射碘從標(biāo)記物上脫落下來(lái)，使用時(shí)應(yīng)除去后再用，否則影響放射免疫分析的精確度。

⑵ 免疫化學(xué)活性鑒定：采用碘標(biāo)記的抗原，通常由于氧化劑的作用可引起部分活性的損傷，而采用³H、¹⁴C等標(biāo)記的抗原，則不改變抗原的化學(xué)結(jié)構(gòu)。免疫活性的檢查方法：以小量的標(biāo)記抗原加過(guò)量的抗體，在適當(dāng)?shù)臈l件下充分反應(yīng)后，分離B、F，分別測(cè)定其放射性，算出百分結(jié)合率。此值應(yīng)在80%以上，最大可超過(guò)90%。該值越大，表示標(biāo)記的免疫化學(xué)活性損失越少。

⑶ 放射強(qiáng)度：放射性強(qiáng)度以比度表示。即單位重量抗原的放射性強(qiáng)度。比度越高，敏感性越高。因此根據(jù)測(cè)定需要的敏感度，要求適當(dāng)比度的標(biāo)記抗原。標(biāo)記抗原比度的計(jì)算是依據(jù)放射性碘的利用率。

分離方法	(B) 抗原抗體復(fù)合物	(F) 游離抗原
平衡透析 清蛋白或葡聚糖衣 活性炭吸附 凝膠過(guò)濾 微孔濾膜過(guò)濾 電泳和層析電泳 雙抗體法 固相抗體法 硫酸胺沉淀法 聚乙二醇(分子量6 000)	在透析袋內(nèi) 不被活性炭吸附離心 后于溶液中 先被洗脫 在醋酸纖維膜上 在 球蛋白電泳帶 被第二抗體沉淀 結(jié)合到固相物上 離心后于沉淀中 離心后于沉淀中	袋內(nèi)外濃度相等 被活性炭吸附于沉淀中 后被洗脫 通過(guò)濾膜被洗掉 以其自己的電泳泳動(dòng)度移動(dòng) 離心后在上清液中 在溶解相中 在溶液中 在溶液中

以此抗體用量，加入不同稀釋度的已知抗原和標(biāo)記的抗原作用一定時(shí)間后，分離B、F，測(cè)B的放射性，以標(biāo)記Ag與抗體復(fù)合物的脈沖數(shù)或結(jié)合率為縱坐標(biāo)，以未標(biāo)記抗原濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)作圖。如得不到直線可通過(guò)logit計(jì)算，將曲線換成直線。在坐標(biāo)上，曲線的斜率最大的部分是放射免疫測(cè)定的工作范圍。斜率越大，敏感性越高，測(cè)定范圍小。斜率小，工作范圍大，而敏感性就較差。