一、定義；
免疫PCR是利用抗原抗體反應(yīng)的特異性和PCR擴(kuò)增反應(yīng)的極高靈敏性而建立的一種微量抗原檢測(cè)技術(shù)。
用抗體檢測(cè)抗原是免疫學(xué)的最基本方法，用酶或同位素標(biāo)記抗體可使檢測(cè)的敏感性提高，常用的定量檢測(cè)方法ELISA和RIA均基于標(biāo)記分子可以使檢測(cè)的信號(hào)增強(qiáng)。免疫PCR是在ELISA的基礎(chǔ)上建立起來的新方法，用PCR擴(kuò)增代替ELISA的酶催化底物顯色。PCR具有很強(qiáng)的放大能力，其可以定量地檢測(cè)DNA和RNA，具有非常高的敏感性和特異性，因此，將與抗原結(jié)合的特異抗體通過連接分子與DNA結(jié)合，再經(jīng)PCR擴(kuò)增，由此定量檢測(cè)抗原使敏感性高于ELISA和RIA。
二、基本原理：
免疫PCR主要由兩個(gè)部分組成，第一部分的免疫反應(yīng)類似于普通的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)的測(cè)定過程;第二部分即通常的PCR檢測(cè)，抗原分子的量最終由PCR產(chǎn)物的多少來反映。第一步中，首先用待測(cè)抗原(如牛血清白蛋白(ESA))包被微滴板孔，再加入相應(yīng)的特異抗體，于是抗體就與固相上的抗原結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物，蛋白A-鏈親合素(Protein A-Streptavidin)嵌合體(重組融合蛋白)中的蛋白A部分可與固相上抗原抗體復(fù)合物中的抗體IgG結(jié)合，而鏈親合素部分可與生物素化的pUC19(質(zhì)粒DNA) (Biotin-pUC19)中的生物素反應(yīng)，從而將特定的DNA間接吸附于固相。接下來，就是第二步中的PCR過程，第一步中吸附于固相的pUC19質(zhì)粒DNA在相應(yīng)的引物存在下，可經(jīng)PCR在幾小時(shí)內(nèi)而放大數(shù)百萬倍，PCR產(chǎn)物的多少與固相上抗原的量成正比。
PCR由 ①待測(cè)抗原；②生物素化抗體；③親和素（連接分子）；④生物素化DNA；⑤PCR擴(kuò)增五部分構(gòu)成。
1 待檢抗原
被檢測(cè)的樣品可以是抗原，或者是作為抗原的某種抗體。待檢的抗原可以直接吸附于固相，這一過程與ELISA試驗(yàn)是相同的，因此有些吸附性差的抗原不能應(yīng)用目前介紹的免疫PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，需要對(duì)免疫PCR進(jìn)行改進(jìn)，以便能夠檢測(cè)吸附性差的抗原。免疫PCR的后續(xù)過程需PCR擴(kuò)增，目前有些方法應(yīng)用的固相板或管是特殊用于免疫PCR，并且有些PCR僅可以直接用微量板進(jìn)行擴(kuò)增，這樣可以簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)過程和提高檢測(cè)的精確性。免疫PCR具有非常高的敏感性，特別適用于檢測(cè)微量抗原。
2 特異抗體
免疫PCR中的特異抗體是對(duì)應(yīng)于待檢抗原，與ELISA一樣，抗體的特異性和親合力將影響免疫PCR的特異性和敏感性。一般均選用單克隆抗體，這個(gè)抗體常采用生物素標(biāo)記，通過親和素再結(jié)合DNA。
3 連接分子
連接分子是連接特異抗體與DNA之間的分子。目前介紹的方法中均是通過生物素與親和素系統(tǒng)使特異抗體與DNA連接，生物素和親和素作為免疫PCR的連接分子在連接方式上有許多差異。Sano首次報(bào)道PCR時(shí)用的是重組葡萄球菌A蛋白-親和素嵌合蛋白(SPA-親和素)。其具有結(jié)合IgG和生物素的兩個(gè)位點(diǎn)，因此可以將IgG與生物素化的DNA連接成復(fù)合物。由于重組的SPA-親和素沒有商品試劑，且SPA不但可以結(jié)合特異抗體的IgG，而且還可以與樣品中吸附于固相的無關(guān)IgG結(jié)合，特別是檢測(cè)的抗原就是某種IgG，因此，Ruzicke認(rèn)為Sano的免疫PCR本底高和特異性差。Ruzicke用商品化的親和素系統(tǒng)試劑建立了一種免疫PCR，這種方法是先將親和素與生物素化的DNA預(yù)結(jié)合成復(fù)合物，然后再與結(jié)合固相的特異性抗體結(jié)合，這種方法存在的問題是親和素與生物素化的DNA分子預(yù)結(jié)合時(shí)二者的分子比例并不是等同的，一個(gè)親和素分子可以結(jié)合4個(gè)分子生物素，因此在預(yù)結(jié)合時(shí)生物素化的DNA分子不能過多，否則DNA分子上的生物素將親和素完全飽和，親和素再無結(jié)合生物素化抗體的能力;但在低飽和生物素化DNA時(shí)，親和素結(jié)合的生物素化DNA存在許多種類的復(fù)合物，甚至還有游離的親和素，只有部分結(jié)合生物素化DNA的親和素才能起到連接分子的作用，因此，這樣預(yù)結(jié)合的親和素和生物素化DNA是一均質(zhì)性很差的混合物。雖然預(yù)結(jié)合的復(fù)合物可以減少測(cè)試過程中的1次孵育和沖洗，但是這樣的復(fù)合物作為連接分子必然導(dǎo)致敏感性低和誤差大，并且每次制備的連接分子均有差異，從而導(dǎo)致重復(fù)性差。
Hong zhou等建立了一種免疫PCR方法，連接分子是鏈親和素，在連接抗體和DNA時(shí)是以游離的方式加入，這樣鏈親和素先與生物素化抗體結(jié)合，沖洗后，再加入生物素化的DNA。這個(gè)方法雖然多了1次孵育和沖洗過程，但具有較好的敏感性和重復(fù)性。
4 DNA和PCR系統(tǒng)
免疫PCR中的DNA是一指示分子，用DNA聚合酶將結(jié)合于固相上的DNA特異放大，由此定量檢測(cè)抗原。免疫PCR的敏感性高于ELISA主要是應(yīng)用了PCR強(qiáng)大的擴(kuò)增能力。免疫PCR中的DNA分子可以選擇任何DNA，但要保證DNA的純度，且有較好的均質(zhì)性，盡可能不選用受檢樣品中可能存在的DNA。一般可選用質(zhì)粒DNA或PCR產(chǎn)物等。DNA的生物素化是用生物素標(biāo)記的dATP或dUTP通過DNA聚合酶標(biāo)記在DNA分子上，一般是一個(gè)分子DNA標(biāo)記兩個(gè)生物素，標(biāo)記率可達(dá)百分之百。生物素化的DNA用量需預(yù)先選定，過多易出現(xiàn)非特異結(jié)合而引起本底過高，過低將導(dǎo)致敏感性低和出現(xiàn)不同濃度抗原得出同樣結(jié)果的飽和現(xiàn)象。
免疫PCR的PCR擴(kuò)增系統(tǒng)與一般PCR一樣，主要包括引物、緩沖液和耐熱DNA聚合酶。由于免疫PCR需用固相進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)，同時(shí)又需要對(duì)固相結(jié)合的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，因此，免疫PCR固相的選擇應(yīng)根據(jù)具體情況確定。用微量板作為固相必須有配套的PCR儀，以使可以用微量板直接擴(kuò)增，否則需要用PCR反應(yīng)管作為固相擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳或聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，根據(jù)PCR產(chǎn)物的大小選擇兩種凝膠的濃度。電泳后凝膠經(jīng)染色和拍照記錄結(jié)果，再檢測(cè)底片上PCR產(chǎn)物的光密度，并與標(biāo)準(zhǔn)品比較就可以得出待檢抗原量。
三、主要程序
（一）抗原 生物素化抗體→抗原-生物素化抗體復(fù)合物；
（二）加親合素→抗原-生物素化抗體-親合素復(fù)合物；
（三）加生物素化DNA→抗原-生物素化抗體-親合素-生物素化DNA；
（四）PCR擴(kuò)增生物素化DNA部分。
四、制作方法
（一）制備生物素化DNA
將噬粒 BLuescript skt，用生物素標(biāo)記的M13引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增制備出含T3和T7引物序列的280bp DNA片段，即為生物素化DNA。
（二）免疫PCR模式
1 試劑
包被緩沖液:20mmol/L Tris-HCI(pH9.5)，含150mmol/L NaCl和0.02%NaN3;
洗滌液:20mmol/L Tris-HCI(pH7.5)，含150mmol/LNaCl0.1mmol/L EDTA和0.1%Tween20;
稀釋液:20mmol/L Tris-HCI(pH7.5)，含150mmol/L NaCl0.45%脫脂奶及變性鮭魚精DNA (0.1mg/ml)
2 操作
1)包被
用包被緩沖液稀釋抗原(BSA)，加入微滴板中(45μl孔)，4℃過夜(約15h)，用洗滌液洗板3次×5min。
2)封閉:
每孔加200μl含4.5%脫脂奶及變性鮭魚精子DNA(1mg/ml)、0.1mmol/L EDTA的20mmol/L Tris-Hcl(pH7.5)(含150mmol/L NaCl緩沖液，37℃溫育80min，洗板數(shù)次。
3)抗原抗體反應(yīng):
用釋釋液1:8000稀釋單克隆抗BSA抗體，每孔加50μl，室溫(～22℃)下45min，洗板孔15次×10min，去除未結(jié)合的抗體分子。
4)鏈親合一蛋白A結(jié)合反應(yīng):
每孔加入50μl用稀釋液稀釋的已與生物素-pUC19結(jié)合的鏈親合素-蛋白A嵌合體，室溫(～22℃)50min，使得嵌合體-pUC19結(jié)合于固相的抗原抗體復(fù)合物上，然后洗板15次×10min，再用無NaN3的TBS洗3次，然后即可將微滴板用于后面的PCR反應(yīng)。
5)PCR
實(shí)驗(yàn)條件 50mmol/L KCI、10mmol/L Tris-HCI(20℃pH8.3)、1.5mmol/LMgCl2、明膠(10μg/ml)、0.8mmol/LdNTPs(每種0.2mM)、2μM引物(每一引物1μM)和TaqDNA多聚酶(50U/ml)。
PCR周期 PCR前，用紫外線(UV)(254nm)照射上述反應(yīng)混合物，然后將之加入到微滴板孔中，每孔40μl，再加20μlUV照射的石蠟覆蓋，按下述溫度在PCR儀上進(jìn)行PCR周期:起始變性94℃5min;30個(gè)周期:變性94℃5min，退火58℃1min，延伸72℃1min，最后延伸72℃ 5min，得到的PCR產(chǎn)物為特定的261bp的片段。
參考流程
1. 用0.85% NaCl將細(xì)菌溶液稀釋至一定濃度。
2. 加50μl于微孔板內(nèi)，4℃過夜。同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照（加50μl 0.85% NaCl于另一孔內(nèi)）。
3. 用400μl的0.05% 溫20pBS（以下簡(jiǎn)稱TPBS），洗滌五次。
4. 加入2.25%的100μl正常山羊血清(NGS) PBS封閉2小時(shí).
5. 用含0.15% NGS的TPBS洗3次.
6. 加入100μl用0.75% NGS適當(dāng)稀釋的單克隆抗體(內(nèi)含100μg的鮮魚精DNA),室溫孵育30min.
7. 用TPBS洗滌五次.
8. 加入50μl適量稀釋的生物素化抗鼠IgG抗體,室溫孵育30min.
9. 用TPBS洗滌五次.
10.加入60μl適量稀釋的生物素化DNA和親和素,室溫孵育30min.
11.用TPBS洗滌五次,再用HPLC級(jí)水洗三次.
12.PCR擴(kuò)增:加入50μl PCR反應(yīng)液(內(nèi)含T3和T7引物),95℃ 60sec,50℃ 110sec,72℃ 110sec,循環(huán)30次.取PCR產(chǎn)物10μl于1.7%瓊脂糖凝膠上電泳,和核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)相比較,在相應(yīng)的位置郵現(xiàn)電泳帶為陽性.必需時(shí)將電泳結(jié)果照像,進(jìn)行定量分析.
3 PCR產(chǎn)物的檢測(cè)與定量技術(shù)
1）凝膠檢測(cè)系統(tǒng) 用凝膠掃描儀或計(jì)算機(jī)輔助視頻設(shè)備對(duì)溴化乙錠染色的瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行定量，放射性標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物可通過放射自顯影定量測(cè)定，最近用自動(dòng)DNA測(cè)序儀檢測(cè)熒光標(biāo)記的核酸，這種方法可準(zhǔn)確測(cè)量擴(kuò)增產(chǎn)物的大小，而且其檢測(cè)靈敏度達(dá)fg水平，但由于自動(dòng)DNA序列儀和熒光標(biāo)記引物極為昂貴，所以現(xiàn)在僅用于研究。
2）HPLC檢測(cè)系統(tǒng) 此法的優(yōu)點(diǎn)為PCR產(chǎn)物不用純化，對(duì)未標(biāo)記的產(chǎn)物靈敏度可達(dá)fg水平，對(duì)標(biāo)記產(chǎn)物的檢測(cè)限度可能更低。HPLC能區(qū)分不同分子的大小，可允許我們使用不同大小的內(nèi)標(biāo)衡量擴(kuò)增的效率。
3） 固相測(cè)定系統(tǒng) 最常用的為96孔聚苯乙烯微量滴定板，可用儀器比色或讀數(shù)，可用親合素分子通過疏水相互作用包被滴定板，此固相系統(tǒng)可特異結(jié)合生物素或生物素化的分子可用于生物素化的PCR產(chǎn)物的定量，如用生物素和地高辛雙重標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物可用微量滴定板法定量，將生物素和地高辛同時(shí)標(biāo)記PCR產(chǎn)物的方法有三種途徑:①在反應(yīng)混合物中同時(shí)加入地高辛和生物素標(biāo)記的脫氧核苷酸類似物(DIG-/Bio-dUTP);②加入生物素化的引物1和DIG-dUTP;③加入生物素引物1和地高辛標(biāo)記的引物2。定量方方法為:雙重標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物用乙醇沉淀以去除未結(jié)合的標(biāo)記物，然后加至親合素包被的微量滴定板上溫育至少2小時(shí)，洗滌數(shù)次后，與DIG抗體:AP結(jié)合物溫育，根據(jù)其底物不同可產(chǎn)生不同的顏色，親合素介導(dǎo)的固相捕獲生物素標(biāo)記靶分子的技術(shù)是一個(gè)有效、靈活和容易操作的技術(shù)，將成為定量PCR的一個(gè)關(guān)鍵技術(shù)。
4）SPA(Scintillation Proximity Assay)系統(tǒng) 用親合素包被的氟微球作為固相載體，用生物素標(biāo)記引物，在擴(kuò)增時(shí)摻入氟化的核苷酸，擴(kuò)增完成后，加入已包被的氟微球以捕獲生物素化的PCR產(chǎn)物，此捕獲過程可使與氟微球緊密結(jié)合，氟被氘激發(fā)產(chǎn)生光脈沖，可用閃爍計(jì)數(shù)儀測(cè)量。與比色法相比，此法具有更大的線性范圍。
5）點(diǎn)雜交檢測(cè)系統(tǒng) 將擴(kuò)增產(chǎn)物變性后固定于尼龍膜表面，與標(biāo)記的DNA探針雜交，亦可將序列特異的寡核苷酸探針通過多聚T(poly T)尾巴固定于膜上，與變性后的已標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物雜交，在后者由于靶基因不是直接結(jié)合于膜表面，故其反應(yīng)動(dòng)力學(xué)接近于液相，反應(yīng)速度快，通常使用生物素化的探針或擴(kuò)增產(chǎn)物，用親合素-AP結(jié)合物產(chǎn)生顏色斑點(diǎn)，通過與已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)比較顏色強(qiáng)度進(jìn)行定量。
6） 電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng) 通過親合素-生物素系統(tǒng)將擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合于磁性珠，然后與2，2'-聯(lián)吡啶-釕螯合物(TBR)標(biāo)記的探針雜交，加入三丙胺(tripropylamine，TPA)溶液，并轉(zhuǎn)移至電化學(xué)發(fā)光儀的檢測(cè)池，當(dāng)電極的電壓增加至一定水平時(shí)TPA和TBR都瞬時(shí)氧化，TPA氧化后生成一種不穩(wěn)定的、具有高度還原性的中間物質(zhì)，可與氧化的TBR反應(yīng)，使之進(jìn)入激發(fā)態(tài)，當(dāng)由激發(fā)態(tài)變?yōu)榛鶓B(tài)時(shí)可發(fā)射出620nm的光，發(fā)光強(qiáng)度與TBR標(biāo)記物的量成正比，通過發(fā)光強(qiáng)度對(duì)PCR產(chǎn)物定量，此法的敏感性為amol水平，可自動(dòng)化測(cè)量。
7） DNA酶免疫測(cè)定系統(tǒng) 通過抗DNA單克隆抗體與擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合、再通過酶第二抗體結(jié)合物進(jìn)行定量測(cè)定。此法不需對(duì)引物和擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記，但易出現(xiàn)交叉反應(yīng)和單克隆抗體昂貴的費(fèi)用限制了此法的廣泛應(yīng)用。
8） 激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)法 首先用熒光標(biāo)記物FAM(商品名)的N-羥基琥珀酰亞胺酯衍生物借助氨已基連接臂偶聯(lián)于正向引物的5'-核苷酸上，然后PCR擴(kuò)增，用毛細(xì)管電泳擴(kuò)增產(chǎn)物，最后用氬離子激光光原檢測(cè)器檢測(cè)熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量測(cè)定。此法的優(yōu)點(diǎn)為樣本用量少，可自動(dòng)化檢測(cè)，快速、靈敏和高分辨率。
總之，可用上述方法對(duì)靶基因定量，其準(zhǔn)確性可通過復(fù)管測(cè)定和利用內(nèi)標(biāo)使數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化而得到提高。由于親合素介導(dǎo)的固相捕獲生物素標(biāo)記靶分子的技術(shù)具有有效、靈活和容易操作等特點(diǎn)，有較好的臨床應(yīng)用前景。定量PCR仍然存在技術(shù)上的問題，目前多用于研究，但在腫瘤、細(xì)菌、真菌和病毒性疾病的診斷和治療方面對(duì)此技術(shù)的需求將日益增加。
五、免疫PCR的應(yīng)用和發(fā)展
免疫PCR技術(shù)目前尚處于研究階段，還沒有一個(gè)十分成熟和滿意的方法，配套試劑尚缺乏，所以應(yīng)用的還不多，在報(bào)道的幾種方法中均是用一些已知的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行試驗(yàn)。Sano，Ruzicka和Hong zhou分別用牛血清白蛋白、小鼠IgG和重組人原癌基因產(chǎn)物ETS;蛋白作為待檢抗原進(jìn)行免疫PCR，他們的結(jié)果均表明免疫PCR的敏感性比ELISA高105倍，且PCR產(chǎn)生的背景信號(hào)很弱，可以檢測(cè)到幾百個(gè)分子的抗原，在理論上免疫PCR可以檢測(cè)到一個(gè)分子抗原，因此，免疫PCR特別適用于檢測(cè)一些含量特別少的抗原分子。目前介紹的免疫PCR還存在一些缺點(diǎn)，在報(bào)道的文獻(xiàn)中均采用待檢抗原直接吸附固相，這樣固相的均質(zhì)性必然對(duì)結(jié)果有很大的影響;同時(shí)檢測(cè)的樣品液中其它成分也可以吸咐固相，極易產(chǎn)生背景過高或精確度下降。另外，有些難于吸咐固相的抗原也就不能用免疫PCR檢測(cè)，連接分子的特異性和均質(zhì)性對(duì)PCR影響很大，從理論上看Hong zhou的生物素標(biāo)記抗體和DNA以及用游離的鏈親和素連接抗體和DNA是一比較理想的方法，但是如能做到生物素化抗體、親和素和生物素化DNA3個(gè)分子預(yù)先連接一個(gè)復(fù)合物，那么將簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)過程。PCR擴(kuò)增過程相對(duì)簡(jiǎn)單，如用微量板作為固相需選用配套的PCR儀，否則需將其移入反應(yīng)管內(nèi)，這必然導(dǎo)致很大的誤差，經(jīng)放大可產(chǎn)生顯著差異。固相也可以直接采用某些PCR反應(yīng)管，并且可以直接用一般的PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，但沖洗過程相對(duì)復(fù)雜一些。免疫PCR具有非廣泛的應(yīng)用前景，十分有必要進(jìn)一步完善免疫PCR的實(shí)驗(yàn)過程和配套試劑的研制。
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