六、奶牛胚胎移植產(chǎn)業(yè)化的相關(guān)技術(shù)

    胚胎生物技術(shù)是生物技術(shù)的重要內(nèi)容之一，所包括的具體技術(shù)內(nèi)容和研究的熱點很多，有些技術(shù)已比較成熟，開始或即將用于胚胎移植產(chǎn)業(yè)化的實踐，但尚有很多技術(shù)內(nèi)容仍處于實驗室階段，離實際應(yīng)用還有相當(dāng)?shù)木嚯x。
  （一） 、胚胎的冷凍保存
    胚胎冷凍保存的成功使奶牛的胚胎移植不再受時間和空間的限制，完全可以根據(jù)受體母牛的發(fā)情情況人為確定胚胎移植的時間。其次，使胚胎的國際、國內(nèi)交換以及長期保存成為可能，大大推動了胚胎移植產(chǎn)業(yè)化的進程。
    目前常用的胚胎冷凍方法主要有兩種：
    1、慢性冷凍保存
    此法是將胚胎置于抗凍保護劑溶液中，經(jīng)緩慢降溫，一般降溫速度為1每分鐘攝氏度到3每分鐘攝氏度，達到一定的溫度后投入液氮（-196攝氏度），即可長期保存。經(jīng)冷凍保存的胚胎在移植前經(jīng)解凍進行移植。這種方法由于降溫速度慢，可在胚胎完全凍結(jié)前脫出細(xì)胞內(nèi)的水分，防止冰晶形成對胚胎的傷害。整個冷凍過程需要2-4小時，比較費時。目前已有各種類型的胚胎冷凍儀，可以進行電腦程序控制，保證了每一批的冷凍質(zhì)量。該法已在國內(nèi)外廣泛應(yīng)用，成為一種常規(guī)的胚胎冷凍保存方法。
    2、玻璃化冷凍保存
    此法是將胚胎置于特制的高濃度的冷凍保護液中，只需要幾分鐘的平衡時間即投入液氮中完成冷凍保存過程。胚胎解凍后的生存能力不低于慢速冷凍保存。此法不需冷凍儀和特殊設(shè)備，在沒有實驗室的現(xiàn)場條件下即可操作。由于整個冷凍過程只需幾分種的時間，縮短了操作的時間，具有很好的推廣和應(yīng)用前景。
  （二） 、體外受精
    奶牛的體外受精是指精子和卵子在體外人為控制的實驗室條件下完成受精的技術(shù)，也是奶牛胚胎生產(chǎn)的方式之一，以這種方式得到的胚胎叫體外胚胎。
    目前，進行體外受精的卵子（卵母細(xì)胞）有兩種獲取方法：
    1、宰場剛屠宰的母牛體內(nèi)摘取卵巢，以一定的方法處理后，從卵巢上收集卵母細(xì)胞，要求卵泡直徑為3-10亳米。然后將這些卵母細(xì)胞在二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)成熟，再與經(jīng)獲能處理的公牛精子放在一起完成受精，繼而把受精卵培養(yǎng)至囊胚階段進行移植或冷凍保存。從廢棄的卵巢中采集卵母細(xì)胞生產(chǎn)胚胎的方式，材料來源豐富，生產(chǎn)成本低，便于工廠化操作，可做到成批生產(chǎn)的目的。存在問題是母牛的來源及系譜無法確定；其次，這類胚胎移植的受胎率低，應(yīng)用時應(yīng)慎重考慮。
    2、從活體母牛卵巢直接收集卵母細(xì)胞
    這種方法要借助超聲波探測儀、內(nèi)窺鏡或腹腔鏡等直接由活體母牛的卵巢上吸取可用的卵母細(xì)胞。隨后的體外培養(yǎng)和受精過程與屠宰場獲取的卵巢卵母細(xì)胞相同。
    值得注意的是不管采用哪種方法生產(chǎn)的體外胚胎普遍存在活力較低，移植后產(chǎn)犢率低，胎兒初生重高，容易造成母牛難產(chǎn)等實際問題。
  （三） 、胚胎切割
    胚胎切割是指運用顯微鏡操作儀或其他簡單設(shè)備將附植前的囊胚期胚胎分割為若干具有繼續(xù)發(fā)育潛能部分的技術(shù)，是提高胚胎利用率的有效方法之一。
    在進行胚胎切割時為了便于操作和切割后的胚胎發(fā)育，一般選用發(fā)育到桑椹胚或囊胚最為適宜。一般借助微針或微刀對準(zhǔn)胚胎內(nèi)細(xì)胞團的部分進行均等的直接下切，以保證切割后的部分有均等的發(fā)育能力。從理論上講胚胎的切割可能是無限的，但是實踐證明只有二分胚的發(fā)育能力最強。近幾年通過實驗證明，二分胚直接移植的受胚率也可達40%以上，這無異是提高了胚胎利用率，但對這一技術(shù)仍需加強研究，簡化操作，提高效率。
    五、胚胎的性別控制
    奶牛的性別控制是指采用某些人為的技術(shù)方法控制受精后胚胎性別，這是從根本上控制后代的性別比例，又稱性比控制。目前，人們將奶牛早期胚胎在移植前進行性別鑒定，以達到按生產(chǎn)需要獲得單一性別犢牛的需要的方法也納入奶牛性別控制內(nèi)容。
    奶牛只有母牛產(chǎn)奶，一般情況下，非超群公、母牛所生的公犢生產(chǎn)價值極低。無論采用何種技術(shù)方法使奶牛多產(chǎn)母牛、少產(chǎn)公牛一直是人們長期努力的目標(biāo)。一些方法雖然幾經(jīng)努力，但收效甚微。下面僅介紹兩種奶牛性別控制的方法，不久將對奶牛的性別控制發(fā)揮明顯作用。
     (一）、X和Y精子的分離
目前，X和Y精子的分離的準(zhǔn)確而有效的方法是流式細(xì)胞器分離。其理論根據(jù)是X精子是DNA的含量比Y精子高3-4%。具體的方法是：用特異的染料對精子進行染色，隨后將精子連同少量稀釋液逐一通過流式細(xì)胞器的激光束，其探測器可感知精子染色后的發(fā)光強度并將這一信息傳遞給計算機，經(jīng)分辨后計算機令液晶充電器使發(fā)光較強的精子分離，進入兩個不同的收集容器。這樣，正電荷收集器容器得到的是X精子，負(fù)電荷收集器容器則為Y精子。用分離后的精子進行人工受精、體外受精或是顯微受精就可以得到單一性別率高的胚胎或犢牛。國外此法已開始用于商業(yè)化的運作，分離的準(zhǔn)確率達90%以上。每小時可得到一個輸精劑量的分離精子。存在的主要問題是：流式細(xì)胞器的造價很高，投入大；分離的速度雖有較大提高，但也有下降趨勢。隨著這一技術(shù)的不斷改進和提高，這一性別控制技術(shù)將給奶牛業(yè)帶來巨大效益和廣闊的應(yīng)用前景。
  （二）、SRY片段PCR擴增胚胎性別鑒定法
    最近10年來發(fā)展的用公牛特異性DNA探針和PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）擴增技術(shù)對奶牛早期胚胎進行性別鑒定的一種準(zhǔn)確有效的方法。其主要操作步驟是：從被測胚胎取部分卵裂球用以提取DNA，再用SRY基因的片段作引物，以所取的胚胎細(xì)胞DNA為模板進行PCR擴增，最后用SRY特異探針對擴增的產(chǎn)物進行檢測。雄性胚胎顯示呈陽性，雌性胚胎為陰性。也可對擴增產(chǎn)物進行電泳，根據(jù)SRY條帶的有無判斷胚胎為雄、雌。隨著這項技術(shù)的深入研究和進展，目前只需幾個卵裂球即可完成檢測的取樣，減少了對胚胎的傷害。經(jīng)鑒定的胚胎，移植后產(chǎn)犢性別的準(zhǔn)確率可達95%以上。
    此法整個操作只需幾十分鐘，有較好的應(yīng)用前景，已開始了商業(yè)運作。存在的主要問題是需要實驗室條件和檢測人員的技術(shù)水平較高，否則會有假陽性結(jié)果出現(xiàn)，影響準(zhǔn)確率；其次，檢測試劑盒成本較高，無疑會增加被檢測胚胎的成本。

                                             臺州市畜牧獸醫(yī)站