引言

當(dāng)比較HPLC和SFC的多項(xiàng)應(yīng)用時(shí)，有人發(fā)現(xiàn)SFC因超臨界液體的低粘滯度和高擴(kuò)散率而能提供更好的選擇性和更短的分析時(shí)間。

SFC用于制備模式時(shí)可顯著降低成本，這是因?yàn)轲s份通常收集在較小體積的揮發(fā)性醇中而由此減少了相當(dāng)多的純化后續(xù)工作。乙腈（ACN）的持續(xù)短缺也促使多個(gè)行業(yè)對(duì)SFC在分析和純化方面能否替代乙腈依賴性反相液相色譜（RPLC）進(jìn)行評(píng)價(jià)�，F(xiàn)在，科學(xué)家在探尋、企業(yè)也在開(kāi)發(fā)更多適用于SFC的包括UV、FID、MS和ELSD在內(nèi)的檢測(cè)器。

蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD）最初為高效液相色譜（HPLC）進(jìn)行基于質(zhì)量的非揮發(fā)性化合物檢測(cè)而設(shè)計(jì)1。因?yàn)檫@種檢測(cè)機(jī)制不依賴于化合物的光學(xué)屬性，所以ELSD被認(rèn)為是一種通用檢測(cè)器，特別適用于檢測(cè)不存在紫外光發(fā)色團(tuán)的分析物。很多制藥實(shí)驗(yàn)室和化學(xué)實(shí)驗(yàn)室將ELSD與紫外檢測(cè)和質(zhì)譜（MS）同時(shí)使用，以確保用于對(duì)組成各異或比較復(fù)雜的混合化合物進(jìn)行色譜分析的通用檢測(cè)的“真實(shí)性”。ELSD也被發(fā)現(xiàn)可廣泛用于包括膳食補(bǔ)充劑、運(yùn)動(dòng)營(yíng)養(yǎng)品、維生素、有機(jī)食品、飲料、化妝品和美容產(chǎn)品在內(nèi)的天然產(chǎn)品的分析和純化。

我們?cè)鴪?bào)告過(guò)使用SFC ELSD分析運(yùn)動(dòng)飲料中甜味劑的個(gè)案研究2以及對(duì)SFC ELSD試驗(yàn)參數(shù)所進(jìn)行的詳細(xì)評(píng)價(jià)3，這兩項(xiàng)研究均采用分析規(guī)模。我們?cè)诖顺尸F(xiàn)關(guān)于ELSD用于小規(guī)模制備型SFC的可行性研究。我們希望此處所述的結(jié)果能促進(jìn)專(zhuān)業(yè)人員將ELSD并入涉及分析和制備規(guī)模SFC的日常工作流程中。

試驗(yàn)

材料

酮洛芬和對(duì)乙酰氨基酚購(gòu)自西格瑪奧德里奇公司（美國(guó)密蘇里州圣路易斯市）。將酮洛芬和對(duì)乙酰氨基酚溶解于HPLC級(jí)甲醇中，制得用于分析試驗(yàn)的0.5 mg/mL儲(chǔ)備液和用于純化的5 mg/mL儲(chǔ)備液。硅膠柱（分析型：4.6 x 250 mm，填充5 μm顆粒；制備型：10 x 250 mm，填充6 μm顆粒）購(gòu)自普林斯頓色譜儀器公司（美國(guó)新澤西州普林斯頓）。

色譜分析

各項(xiàng)試驗(yàn)均使用配備沃特世2998型光電二極管陣列（PDA）檢測(cè)器和沃特世ELSD（美國(guó)馬薩諸塞州米爾福德）的一臺(tái)SFC Investigator II儀器（沃特世子公司T harSFC，美國(guó)賓夕法尼亞州匹茲堡）進(jìn)行。

ELSD信號(hào)（模擬信號(hào)輸出）通過(guò)模數(shù)轉(zhuǎn)換器傳輸?shù)絊uperChrom軟件。一個(gè)10 μL的定量環(huán)用于各次分析型進(jìn)樣，而一個(gè)200 μL的定量環(huán)則用于各次制備型進(jìn)樣。ELSD使用一根內(nèi)徑0.010英寸的不銹鋼三通和25 μ x50 cm的PeekSil管在PDA和反壓調(diào)節(jié)器之間分流出來(lái)。分析型方法在流速為4 mL/分鐘（85:15 CO2/甲醇）、反壓為150巴和溫度為40?C的條件下運(yùn)行。分析型方法的ELSD條件設(shè)置如下：增益=1000、噴霧器溫度= 45?C、管道溫度= 45?C、壓力= 30 psi。制備型方法在流速為10 mL/分鐘（80:20 CO2/甲醇）、反壓為150巴和溫度為40?C的條件下運(yùn)行。ELSD條件設(shè)置如下：增益=1000、噴霧器溫度= 28 ?C、管道溫度= 50 ?C、壓力= 60 psi。收集裝置上的補(bǔ)償泵被設(shè)置為每分鐘用泵抽吸2 mL甲醇。對(duì)于純化應(yīng)用，以200μL的進(jìn)樣量連續(xù)進(jìn)樣五次，或者說(shuō)每種化合物進(jìn)樣1 mg（兩種化合物共2 mg），那么每種化合物的進(jìn)樣總量為5mg（兩種化合物共10 mg）。

結(jié)果和討論

圖1顯示了使用ELSD和UV得出的酮洛芬/對(duì)乙酰氨基酚混合物的分析型SFC色譜圖。ELSD和UV信號(hào)之間略微存

在時(shí)間滯后（約2秒）。由于ELSD信號(hào)用于餾份觸發(fā)，因此滯后時(shí)間對(duì)制備型色譜特別重要。應(yīng)充分注意確保信

號(hào)處理時(shí)間與流出液達(dá)到收集閥的時(shí)間保持一致，或者需要進(jìn)行適當(dāng)?shù)挠?jì)時(shí)補(bǔ)償，以盡可能減少收集過(guò)程中的

損失。例如，在我們的試驗(yàn)中使用了一根25 μ × 50 cm的PeekSil管，以將主流量分流到ELSD中。首選小內(nèi)徑管，

以盡可能減少進(jìn)入ELSD的流量，實(shí)現(xiàn)樣本損失量的最小化。然而，管長(zhǎng)由UV和ELSD信號(hào)之間的時(shí)間滯后而決

定。較長(zhǎng)的管子將因抗性增強(qiáng)而進(jìn)一步減少流入ELSD的樣本量；然而，這也將增加兩種信號(hào)之間的時(shí)間滯后。

在本例中，2秒的時(shí)間滯后小于總峰寬的3%。

其次，我們優(yōu)化了制備型進(jìn)樣的ELSD設(shè)置，結(jié)果如圖2所示。從分析型到制備型設(shè)置出現(xiàn)了兩個(gè)改變：流速?gòu)? mL/分鐘提高到10 mL/分鐘，改性劑百分比從15%增加20%；這兩種改變將導(dǎo)致流入ELSD的液體增多。在我們的前一項(xiàng)研究3中，對(duì)氣體流速和蒸發(fā)溫度的作用進(jìn)行了描述。簡(jiǎn)言之，氣體流速越高，停留時(shí)間就越短，出現(xiàn)散射的次數(shù)也越少，進(jìn)而信號(hào)越差。氣體流速越高，噴霧過(guò)程中所形成的小顆粒就越多。粒徑的減小也導(dǎo)致散射光的強(qiáng)度降低。此外，也建議將蒸發(fā)溫度維持在盡可能低的水平下，以保持粒徑的一致性，并通過(guò)增強(qiáng)溶解結(jié)晶作用而獲得更好的信號(hào)。這一點(diǎn)與圖2所示的結(jié)果吻合：增加氣體流速和降低蒸發(fā)溫度似乎可產(chǎn)生帶有更少“尖峰”的更窄色譜峰。注意制備型進(jìn)樣的樣本濃度要高得多；靈敏度不再是主要關(guān)注點(diǎn)。恰恰相反，優(yōu)化目標(biāo)在于產(chǎn)生可靠且重現(xiàn)性好的信號(hào)。有代表性的制備型SFC色譜圖見(jiàn)圖3。圖3(b)顯示了疊加進(jìn)樣的SFC色譜圖。循環(huán)時(shí)間通過(guò)進(jìn)行疊加進(jìn)樣而更為縮短，進(jìn)一步提高了產(chǎn)能�；厥章屎图兌韧ㄟ^(guò)再次進(jìn)樣所收集的餾份并將由此得到的峰面積與預(yù)先繪制的校準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較而確定。在本研究中，酮洛芬和對(duì)乙酰氨基酚的回收率分別為88%和84%，純度分別為98%和100%。





 

結(jié)論
 

在本研究中，我們證實(shí)了使用ELSD可觸發(fā)小規(guī)模制備型SFC的餾份收集。本研究所用標(biāo)準(zhǔn)品的回收率大于84%，純度大于98%。儀器配置和ELSD優(yōu)化方面的根本原則應(yīng)該同樣適用于大規(guī)模制備型SFC。