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一、引言
根據(jù)FDA的規(guī)定1，手性色譜已經(jīng)成為藥物開發(fā)早期為通過藥理學、毒理學和臨床信息準確鑒定單一純對映體并進行分離的首選工具。
超臨界流體色譜（SFC）因其具有更高的效率、更大的通量和更寬的適用性而被證實成為手性化合物分離的一種主流技術。手性SFC越來越受到關注并且其應用范圍不斷擴大，在一些情況下逐漸成為首選方法。
通常情況下，對映體混合物含有一定數(shù)量的雜質，對于常用的疊加進樣和基于信號閾值的收集策略而言（例如UV/ PDA檢測），這些雜質可降低實際純化過程的效率。多數(shù)情況下，進行一步預凈化是必要的，但因存在資金和工作量限制卻是不實際的。這需要一種能將對映體與其它雜質鑒別開來的多功能檢測方案。除了UV/PDA檢測器之外，3100型質譜檢測器是一種可廣泛用于手性分離的理想選擇。
在本應用文獻中，展示了質譜引導的Prep 100 SFC系統(tǒng)及其在開放床式平臺上進行疊加進樣和收集的功能，并被證實是一種手性化合物純化的有效工具。下文回顧并描述了用于手性分離案例的系統(tǒng)配置和方法。
二、試驗
化學品
CO2由Airgas（Salem，NH，USA）公司提供，并以加壓液體的形式在大約1100 - 1300 psi的條件下，通過內置管道供應給質譜引導的Prep 100 SFC系統(tǒng)。甲醇和反式芪氧化物（T SO，MW：196）由Sigma-Aldrich（St.Louis,MO ,USA）提供。
SFC色譜柱
ChiralPak AD-H和ChiralCel OD-H（均為 21 mm x 250 mm、5 μm）由Chiral Technologies公司（West Chester，PA，USA）提供。
SFC系統(tǒng)
質譜引導的Prep 100 SFC系統(tǒng)配備一個附加的疊加進樣器。
2767型樣品管理器配置為一個簡化型重復餾分收集器
三、方法條件
SFC梯度和流速程序
對于所述的全部數(shù)據(jù)而言，100 g/分鐘的最大總流速與各種等度的改性劑程序配合使用。
質譜檢測器的條件
用于各種試驗的3100型質譜檢測器標準ESI模式使用以下關鍵參數(shù)：
毛細管電壓： 3.5 KV
錐孔電壓： 40.0 V
二級錐孔電壓： 3.0 V
射頻透鏡電壓： 0.1 V
源溫度： 150 °C
脫溶劑氣溫度： 350 °C
脫溶劑氣體流速： 400 L/小時
錐孔氣體流速： 60 L/小時
0.1%的甲酸-甲醇溶液用作補償液流進入質譜，以提高電離效率。
數(shù)據(jù)管理：MassLynx/FractionLynx，第4.1版
四、結果和討論
疊加進樣模式下的純化放大
手性分離中通用的最佳做法是利用疊加進樣模式進行樣品進樣和餾分收集，這可實現(xiàn)效率最大化并降低生產成本。
在含有一定雜質的復雜體系中，質譜引導的系統(tǒng)可以鑒定和選擇性的收集感興趣的目標化合物，并正確的忽略不需要雜質。因而，該系統(tǒng)對于手性化合物的SFC純化，具有高效、適用范圍廣的特點，并成為手性藥物開發(fā)的常規(guī)主流工具。
我們對質譜引導的Prep100 SFC系統(tǒng)進行了一定的改造，以便將該系統(tǒng)用于手性化合物分離純化時達到其最大效益，其中包括添加了一個專用進樣器并改變了收集床布局以容納更大的容器，從而可重復收集對映體的餾分。
層疊進樣/進樣器的啟用
Prep 100 SFC系統(tǒng)整合了一個沃特世疊加進樣模塊，用戶選擇“進樣類型”并輸入疊加進樣的總次數(shù)以及軟件程序中的其它相關參數(shù)，如圖1和圖2所示。以疊加進樣的模式，運行一個自定義的進樣序列，該進樣器可從單一樣品容器中抽取多份等量樣品。
未使用疊加進樣模式時，2767型樣品管理器能繼續(xù)按照“樣品列表”所定義的順序從樣品架上逐個進樣單一樣品。
圖3顯示了對一種雙峰混合物進行疊加進樣后得出的典型色譜圖。紫外和質譜對所需物質的檢測結果均是正確的，從而確保了通過紫外或質譜觸發(fā)可進行可靠而成功的餾分收集。在本例中，紫外信號用作收集觸發(fā)；必要時也可使用質譜信號。
自定義用于單個樣品瓶的收集床布局
質譜引導的Prep 100 SFC系統(tǒng)使用2767型樣品管理器作為專用餾分收集器。在手性化合物純化中，由于餾分收集數(shù)為兩份（或者在某些情況下可能多達四份），因此需要用更大容器及重復式前后收集模式取代一對一模式下的常規(guī)類型試管架。
所以，2767型樣品管理器可通過定義收集的位置及更大容器而進行定制。從而可對同一個對映體的所有疊加進樣序列結果，通過重復式的前后收集方式，收集到相同的收集瓶中。
如圖3所示，兩種對映體餾分分別被收集進1號瓶（粉紅色條帶）和2號瓶（綠色條帶）。這在2767型樣品管理器上以反復模式根據(jù)序列內的單一進樣管線而完成。這表明使用Masslynx軟件和Fractionlynx樣品管理器進行樣品收集的過程是成功的，并且滿足了依據(jù)對映異構體對的信號強度水平進行正確鑒定和收集的關鍵標準。
圖4所示，是對一個包含無關雜質峰與對映異構體對的體系進行分離和選擇性收集的實例。如彩色條帶所示，通過目標化合物的質譜引導，只有兩個分離開的目標化合物被收集，而第三個峰（無關的雜質）沒有被收集。
MassLynx/FractionLynx AutoPurify?平臺擁有眾多高級、適用于復雜工作流程的檢測和收集算法，例如，使用多種檢測器信號進行觸發(fā)的布爾邏輯算法。如果樣品已足夠純凈，那么用戶可選擇使用UV/ PDA進行檢測；如果樣品包含相當數(shù)量的雜質，那么用戶可選擇使用組合型信號和斜率算法以及特定的目標分子量，以確保得到更純的收集餾分。
MassLynx/FractionLynx AutoPurify平臺擁有眾多高級、適用于復雜工作流程的檢測和收集算法，例如，使用多種檢測器信號進行觸發(fā)的布爾邏輯算法。如果樣品已足夠純凈，那么用戶可選擇使用UV/ PDA進行檢測；如果樣品包含相當數(shù)量的雜質，那么用戶可選擇使用組合型信號和斜率算法以及特定的目標分子量，以確保得到更純的收集餾分。
五、結論
已經(jīng)證實質譜引導Prep 100 SFC系統(tǒng)在不同藥物的開發(fā)過程中具有高效、適用性強及用途廣的特點。本文所述的質譜引導Prep 100 SFC系統(tǒng)疊加進樣和收集的附加特點使其對手性分離具有更強的定制能力，從而可為純化實驗室的色譜分析師帶來效益，例如：
■ 多重、多功能檢測模式實現(xiàn)了更高的成功率；
■ 基于開放床式平臺的相同疊加進樣和收集模式簡化了使用方法；
■ 能提供一個遵從行業(yè)和政府規(guī)定的更安全的實驗室環(huán)境。
