細(xì)胞凍存液:

　　50％小牛血清

　　40％不完全培養(yǎng)液

　　10％　DMSO二甲亞砜

　　凍存液最好預(yù)冷，操作動(dòng)作輕柔、迅速。凍存時(shí)從室溫可立即降到0℃，再降溫時(shí)一般按每分鐘降溫2～3℃，待降至-70℃可放入液氮中�；蚣�(xì)胞管降至0℃ 后放-70℃超低溫冰箱，次日轉(zhuǎn)入液氮中。也可以用細(xì)胞凍存裝置進(jìn)行凍存。凍存細(xì)胞要定期復(fù)蘇，檢查細(xì)胞的活性和分泌抗體的穩(wěn)定性，在液氮中細(xì)胞可保存數(shù)年或更長(zhǎng)時(shí)間。

　　五、單克隆抗體的大量生產(chǎn)

　　大量生產(chǎn)單克隆抗體的方法主要有兩種：

　　1.　體外使用旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)管大量培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞，從上清中獲取單克隆抗體。但此方法產(chǎn)量低，一般培養(yǎng)液含量為10～60μg／ml，如果大量生產(chǎn)，費(fèi)用較高。

　　2.　體內(nèi)接種雜交瘤細(xì)胞，制備腹水或血清。

　�、佟�實(shí)體瘤法　對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雜交瘤細(xì)胞按1～3×107／ml接種于小鼠背部皮下，每處注射0.2 ml, 共2～4點(diǎn)。待腫瘤達(dá)到一定大小后一般10～20天則可采血，從血清中獲得單克隆抗體含量可達(dá)到1-10mg／ml。但采血量有限。

　　②　腹水的制備　常規(guī)是先腹腔注射0.5mlPristane降植烷或液體石臘于BaLb／c鼠，1～2周后腹腔注射1×106個(gè)雜交瘤細(xì)胞，接種細(xì)胞7～10天后可產(chǎn)生腹水，密切觀(guān)察動(dòng)物的健康狀況與腹水征象，待腹水盡可能多，而小鼠頻于死亡之前，處死小鼠，用滴管將腹水吸入試管中，一般一只小鼠可獲1～10ml腹水。也可用注射器抽取腹水，可反復(fù)收集數(shù)次。腹水中單克隆抗體含量可達(dá)5-20mg/ml， 這是目前最常用的方法，還可將腹水中細(xì)胞凍存起來(lái)，復(fù)蘇后轉(zhuǎn)種小鼠腹腔則產(chǎn)生腹水快、量多。

　　六、單克隆抗體的鑒定

　　對(duì)制備的McAb進(jìn)行系統(tǒng)的鑒定是十分必要的。應(yīng)對(duì)其做如下方面的鑒定:

　　1.　抗體特異性的鑒定：除用免疫原抗原進(jìn)行抗體的檢測(cè)外，還應(yīng)用與其抗原成分相關(guān)的其它抗原進(jìn)行交叉試驗(yàn)，方法可用ELISA、IFA法。例如①制備抗黑色素瘤細(xì)胞的McAb，除用黑色素瘤細(xì)胞反應(yīng)外，還應(yīng)用其它臟器的腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞進(jìn)行交叉反應(yīng)，以便挑選腫瘤特異性或腫瘤相關(guān)抗原的單克隆抗體。②　制備抗重組的細(xì)胞因子的單克隆抗體，應(yīng)首先考慮是否與表達(dá)菌株的蛋白有交叉反應(yīng)，其次是與其它細(xì)胞因子間有無(wú)交叉。

　　2.　McAb的Ig類(lèi)與亞類(lèi)的鑒定：一般在用酶標(biāo)或熒光素標(biāo)記的第二抗體進(jìn)行篩選時(shí)，已經(jīng)基本上確定了抗體的Ig類(lèi)型。如果用的是酶標(biāo)或熒光素標(biāo)記的兔抗鼠IgG或IgM，則檢測(cè)出來(lái)的抗體一般是IgG類(lèi)或IgM類(lèi)。至于亞類(lèi)則需要用標(biāo)準(zhǔn)抗亞類(lèi)血清系統(tǒng)作雙擴(kuò)或夾心ELISA來(lái)確定McAb的亞類(lèi)。在作雙擴(kuò)試驗(yàn)時(shí)，如加入適量的PEG3％，將有利于沉淀線(xiàn)的形成。

　　3.　McAb中和活性的鑒定：用動(dòng)物的或細(xì)胞的保護(hù)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定McAb的生物學(xué)活性。例如如果確定抗病毒McAb的中和活性，則可用抗體和病毒同時(shí)接種于易感的動(dòng)物或敏感的細(xì)胞，來(lái)觀(guān)察動(dòng)物或細(xì)胞是否得到抗體的保護(hù)。

　　4.　McAb識(shí)別抗原表位的鑒定：用競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)、測(cè)相加指數(shù)的方法，測(cè)定McAb所識(shí)別抗原位點(diǎn)，來(lái)確定McAb的識(shí)別的表位是否相同。

　　5.　McAb親和力的鑒定：用ELISA或RIA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)來(lái)確定McAb與相應(yīng)抗原結(jié)合的親和力。

　　七、影響因素、失敗原因分析

　　由于制備McAb的實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，環(huán)節(jié)多，所以影響因素就比較多，稍不注意就會(huì)造成失敗。

　　其主要失敗原因和影響因素有:

　　1.　污染：包括細(xì)菌、霉菌和支原體的污染。這是雜交瘤工作中最辣手的問(wèn)題。一旦發(fā)現(xiàn)有霉菌污染就應(yīng)及早將污染板棄之，以免污染整個(gè)培養(yǎng)環(huán)境。支原體的污染主要來(lái)源于牛血清，此外，其它添加劑、實(shí)驗(yàn)室工作人員及環(huán)境也可能造成支原體污染。在有條件的實(shí)驗(yàn)室，要對(duì)每一批小牛血清和長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)的細(xì)胞系進(jìn)行支原體的檢查，查出污染源應(yīng)及時(shí)采取措施處理。對(duì)于污染的雜交瘤細(xì)胞可以采取生物學(xué)的過(guò)濾方法，將污染的雜交瘤細(xì)胞注射于BALB／c小鼠的腹腔，待長(zhǎng)出腹水或?qū)嶓w瘤時(shí)，犖^菌取出分離雜交瘤細(xì)胞，一般可除去支原體污染。

　　2.　融合后雜交瘤不生長(zhǎng)：在保證融合技術(shù)沒(méi)有問(wèn)題的前提下主要考慮下列因素①PEG有毒性或作用時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。②牛血清的質(zhì)量太差，用前沒(méi)有進(jìn)行嚴(yán)格的篩選。③骨髓瘤細(xì)胞污染了支原體。④HAT有問(wèn)題，主要是A含量過(guò)高或HT含量不足。

　　3.　雜交瘤細(xì)胞不分泌抗體或停止分泌抗體

　�、佟∪诤虾笥屑�(xì)胞生長(zhǎng)，但無(wú)抗體產(chǎn)生，可能是HAT中A失效或骨髓瘤細(xì)胞發(fā)生突變，變成A抵抗細(xì)胞所致。

　　②　有可能是免疫原抗原性弱，免疫效果不好。

　�、邸�對(duì)于原分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞變?yōu)殛幮�，可能是�?xì)胞支原體污染，或非抗體分泌細(xì)胞克隆競(jìng)爭(zhēng)性生長(zhǎng)，從而抑制了抗體分泌細(xì)胞的生長(zhǎng)。也可能發(fā)生染色體丟失。Goding91982曾提出“三要”“三不要”，可能是防止抗體停止分泌的有效措施。

　　三要:

　　要大量保持和補(bǔ)充液氮凍存的細(xì)胞原管。

　　要應(yīng)用倒置顯微鏡經(jīng)常檢查細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況。

　　要定期進(jìn)行再克隆。

　　三不要:

　　不要讓細(xì)胞“過(guò)度生長(zhǎng)”。因?yàn)榉欠置诘碾s交瘤細(xì)胞將成為優(yōu)勢(shì)，壓倒分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞。

　　不要讓培養(yǎng)物不加檢查地任其連續(xù)培養(yǎng)幾周或幾個(gè)月。

　　不要不經(jīng)克隆化而使雜交瘤在機(jī)體內(nèi)以腫瘤生長(zhǎng)形式連續(xù)傳好幾代。

　　4.　雜交瘤細(xì)胞難以克隆化

　　可能與小牛血清質(zhì)量、雜交瘤細(xì)胞的活性狀態(tài)有關(guān)，或由于細(xì)胞有支原體污染，使克隆化難以成功。若是融合后的早期克隆化，應(yīng)在培養(yǎng)液加HT。

 

 

抗體的制備方法與原理

一、抗血清的制備

　　有了質(zhì)量好的抗原，還必須選擇適當(dāng)?shù)拿庖咄緩剑�才能產(chǎn)生質(zhì)量好（特異性強(qiáng)和效價(jià)高）的抗體。

　�。ㄒ唬┯糜诿庖叩膭�(dòng)物

　　作免疫用的動(dòng)物有哺乳類(lèi)和禽類(lèi)，主要為羊、馬、家兔、猴、豬、豚鼠、雞等，實(shí)驗(yàn)室常用者為家兔、山羊和豚鼠等。動(dòng)物種類(lèi)的選擇主要根據(jù)抗原的生物學(xué)特性和所要獲得抗血清數(shù)量，如一般制備抗r-免疫球蛋白抗血清，多用家兔和山羊，因動(dòng)物反應(yīng)良好，而且能夠提供足夠數(shù)量的血清，用于免疫的動(dòng)物應(yīng)適齡，健壯，無(wú)感染性疾患，最好為///雄性，此外還需十分注意動(dòng)物的飼養(yǎng)，以消除動(dòng)物的個(gè)體差異以及在免疫過(guò)程中死亡的影響。若用兔，最好用純種新西蘭兔，一組三只，兔的體重以2～3kg為宜。

　�。ǘ�）免疫途徑

　　免疫途徑有多種多樣，如靜脈內(nèi)、腹腔內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、淋巴結(jié)內(nèi)注射等，一般常用皮下或背部多點(diǎn)皮內(nèi)注射，每點(diǎn)注射0.1ml左右。途徑的選擇決定于抗原的生物學(xué)特性和理化特性，如激素、酶、毒素等生物學(xué)活性抗原，一般不宜采用靜脈注射。

　�。ㄈ�）佐劑

　　由于不同個(gè)體對(duì)同一抗原的反應(yīng)性不同，而且不同抗原產(chǎn)生免疫反應(yīng)的能力也有強(qiáng)有弱，因此常常在注射抗原的同時(shí)，加入能增強(qiáng)抗原的抗原性物質(zhì)，以刺激機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫反應(yīng)，這種物質(zhì)稱(chēng)為免疫佐劑。

　　佐劑除了延長(zhǎng)抗原在體內(nèi)的存留時(shí)間，增加抗原刺激作用外，更主要的是，它能刺激網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)，使參與免疫反應(yīng)的免疫活性細(xì)胞增多，促進(jìn)T細(xì)胞與B細(xì)胞的相互作用，從而增強(qiáng)機(jī)體對(duì)抗原的細(xì)胞免疫和抗體的產(chǎn)生。

　　常用的佐劑是福氏佐劑（Freund adjuvant）,其成分通常是羊毛脂1份、石臘油5份，羊毛脂與石臘油的比例，視需要可調(diào)整為1：2～9（V/V），這是不完全福氏佐劑，在每毫升不完全佐劑加入1～20mg卡介苗就成為完全佐劑。

　　配制方法：按比例將羊毛脂與石蠟油置容器內(nèi)，用超聲波使之混勻，高壓滅菌，置4℃下保存?zhèn)溆�。免疫前取等容積完全或不完全佐劑與免疫原溶液混合，用振蕩器混勻成乳狀，也可以在免疫前取需要量佐劑置乳缽中研磨，均勻后再邊磨邊滴加入等容積抗原液（其中加卡介苗3～4mg/ml或不加），加完后再繼續(xù)研磨成乳劑，滴于冰水上5～10min內(nèi)完全不擴(kuò)散為止。為避免損失抗原，亦可用一注射器裝抗原液，另一注射器裝佐劑，二者以聚乙烯塑料管連接，然后二者來(lái)回反復(fù)抽吸，約數(shù)十分鐘后即能完全乳化。檢查合格后即以其中一注射器作注射用。

　　（四）免疫方法

　　抗原劑量，首次劑量為300～500μg，加強(qiáng)免疫的劑量約為首次劑量為1/4左右。每2～3周加強(qiáng)免疫一次。加強(qiáng)免疫時(shí)用不完全佐劑，首次免疫時(shí)皮下注射百日咳疫苗0.5ml，加強(qiáng)免疫時(shí)不必注射百日咳疫苗。

　　在第2次加強(qiáng)免疫后2周，從耳緣靜脈取2～3ml血，制備血清，檢測(cè)抗體效價(jià)（見(jiàn)后）。如未達(dá)到預(yù)期效價(jià)，需再進(jìn)行加強(qiáng)免疫，直到滿(mǎn)意時(shí)為止（圖2-3）。當(dāng)抗體效價(jià)達(dá)到預(yù)期水平時(shí)，即可放血制備抗血清。

 

圖2-3 抗體反應(yīng)

　　（五）抗血清的采集與保存

　　家兔是最常用以產(chǎn)生抗體的動(dòng)物，因此這里主要討論兔血的收集。羊等較大動(dòng)物以頸靜脈、動(dòng)脈取血，鼠等小動(dòng)物取血可參閱有關(guān)資料。取兔血有兩種方法，一是耳緣靜脈或耳動(dòng)脈放血，一是頸動(dòng)脈入血，也可心臟采血。取動(dòng)脈或靜脈放血時(shí)，將兔放入一個(gè)特造的木匣或籠內(nèi)，耳露于箱（籠）外，也可由另一人捉住兔身。剪去耳緣的毛，用少許二甲苯涂抹耳廓，30s后，耳血管擴(kuò)張、充血。用手輕拉耳尖，以單面剃須刀或尖的手術(shù)刀片，快速切開(kāi)動(dòng)脈或靜脈，血液即流出，每次可收集30～40ml 。然后用棉球壓迫止血，凝血后洗去二甲苯。二星期后，可在另一耳放血。此法可反復(fù)多次放血。頸動(dòng)脈放血時(shí)，將兔仰臥，固定于兔臺(tái)，剪去頸部的毛，切開(kāi)皮膚，暴露頸動(dòng)脈，插管，放血。放血過(guò)程中要嚴(yán)格按無(wú)菌要求進(jìn)行。

　　收集的血液置于室溫下1h左右，凝固后，置4℃下，過(guò)夜（切勿冰凍）析出血清，離心，4000rpm,10min。在無(wú)菌條件，吸出血清，分裝（0.05～0.2ml），貯于-40℃以下冰箱，或凍干后貯存于4。C冰箱保存。

　�。�六）抗血清質(zhì)量的評(píng)價(jià)

　　在免疫期間，不僅各個(gè)不同的動(dòng)物，而且同一動(dòng)物在不同的時(shí)間內(nèi)抗血清效價(jià)、特異性、親合力等都可能發(fā)生變化，因而必須經(jīng)常地采血測(cè)試。只有在對(duì)抗血清的效價(jià)、特異性、親合力等方面作徹底的評(píng)價(jià)后，才可使用所取得的抗血清。

　　1．效價(jià) 　抗血清的效價(jià)，就是指血清中所含抗體的濃度或含量。效價(jià)測(cè)定的方法常用的是放射免疫法，此法對(duì)所有的抗體均適用。某些由大分子（如蛋白類(lèi)）抗原所產(chǎn)生的抗體，可用雙擴(kuò)散等方法測(cè)定。前者測(cè)定的效價(jià)極為精確。而后者則粗糙得多。

　�。�1）放射免疫法： 以不同稀釋度的抗血清與優(yōu)質(zhì)標(biāo)記抗原混合，孵育24h后，測(cè)定其結(jié)合率。通常以結(jié)合率為50%的血清稀度和為效價(jià)。如某抗血清的結(jié)合率為50%時(shí)的稀釋度為1：15000，則該血清的效價(jià)就是1：15000�？寡�清的效價(jià)，除由抗血清本身的性質(zhì)決定外，還受標(biāo)記抗原的質(zhì)量、孵育時(shí)間，所用稀釋液的成分及其pH等因素的影響，在工作中必須引起注意。（測(cè)定方法見(jiàn)第8章�。�

　�。�2）雙向擴(kuò)散法：利用大分子抗原和抗體在瓊脂平板上擴(kuò)散，兩者在相交處產(chǎn)生沉淀線(xiàn)，以觀(guān)察和判斷抗血清中是否有抗體及其濃度。

　　球脂板的制備：100ml pH7.1 的磷酸鹽緩沖液加到15g的瓊脂內(nèi)，于水浴中加溫，攪拌，使瓊脂完全溶解，趁熱用紗布過(guò)濾，待溶液冷卻到65℃左右時(shí)，加入疊氮鈉（NaN3），使其在溶液中的濃度為0.1%。用移液管把瓊脂放在干凈平皿或玻片上，約3mm厚，待其冷卻，完全凝固后，用打孔器打孔（圖2-4）。中央孔內(nèi)加適量抗原（容量為50μl），周?chē)�各孔�?nèi)分別加入50μl 1：2、1：4、1：8、1：16、1：32及不稀釋的抗血清，37℃下孵育24h，觀(guān)察有無(wú)沉淀線(xiàn)產(chǎn)生，以判斷血清的稀釋度（圖2-5）。

 

圖2-4 雙向擴(kuò)散模型

 

圖2-5 免疫擴(kuò)散試驗(yàn)

　　2．特異性測(cè)定 　　抗血清的特異性或稱(chēng)專(zhuān)一性是指抗血清對(duì)相應(yīng)的抗原及近似的抗原物質(zhì)的識(shí)別能力。特異性好就是抗血清的識(shí)別能力強(qiáng)。通常，特異性是以交叉反應(yīng)率來(lái)表示的。交叉反應(yīng)率低，表示抗血清的特異性好，反之則特異性差。交叉反應(yīng)率一般是用競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線(xiàn)來(lái)判斷的。以不同濃度的抗原和近似抗原物質(zhì)分別做競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線(xiàn)，計(jì)算各自的結(jié)合率（B/T或B/B0），求出各自在IC50時(shí)的濃度，按下列公式計(jì)算交叉反應(yīng)率。

　　S=y/Z×100%

　　S：交叉反應(yīng)率，y：IC50時(shí)抗原濃度，Z：IC50時(shí)近似抗原物質(zhì)的濃度。

　　如某抗原的IC50濃度為90Pg/管，而一些近似抗原物質(zhì)IC50濃度幾乎是無(wú)限大，可以說(shuō)這一抗血清與其它抗原物質(zhì)的交叉反應(yīng)率近似零，即無(wú)交叉反應(yīng)，該抗血清的特異性是好的。

　　3．親合力 　　在免疫學(xué)中， 親合力是指抗體與結(jié)合抗原體的活度或牢固度。抗體與抗原結(jié)合疏松，結(jié)合后會(huì)迅速解離，稱(chēng)為親合力低，反之，親合力高。親合力的高低是由抗原分子的大小，抗體分子的結(jié)合位點(diǎn)與抗原的決定基之間的立體結(jié)構(gòu)型的合適程度決定的。親合力常以親合常數(shù)K表示。K的單位是升/摩爾（L/mol）。在RIA中，K是該抗血清能達(dá)到的最小檢出量（靈敏度）的倒數(shù)，K=1/[H]，[H]是最小檢出量，通常，K的范圍在108～1012L/mol之間，也有高達(dá)1014L/mol的。

　　計(jì)算親合常數(shù)的方法20余種，計(jì)算出的K都不能真實(shí)反映實(shí)驗(yàn)情況，只能作為參考。

　　（七）免疫失敗的可能原因及應(yīng)采取的措施

　　有時(shí)不能獲得滿(mǎn)意的抗血清，可從下列幾方面找原因，并改進(jìn)之。

　�。�1）免疫動(dòng)物的種屬及品系是否合適，可考慮改變動(dòng)物的種屬或品系，或擴(kuò)大免疫動(dòng)物的數(shù)量。

　　（2）抗原質(zhì)量是否良好，可改用其它廠(chǎng)家的產(chǎn)品或改用同一廠(chǎng)家的其它批號(hào)，也可考慮改變抗原分子的部分結(jié)構(gòu)，或改進(jìn)提取方法。

　�。�3）制備的免疫原是否符合要求，可從偶聯(lián)劑，載體、抗原或載體的比例、反應(yīng)時(shí)間等多方面去考慮，并加以改進(jìn)。

　　（4）所用的佐劑是否合適，乳化是否完全，可改用其它佐劑，或加強(qiáng)乳化。

　�。�5）免疫的方法、劑量，加強(qiáng)免疫的間隔時(shí)間和次數(shù)，免疫的途徑是否合適。

　�。�6）動(dòng)物的飼養(yǎng)是否得當(dāng)，如營(yíng)養(yǎng)（飼料、飲水）、環(huán)境衛(wèi)生（通風(fēng)、采光、溫度）是否符合要求，動(dòng)物的健康情況是否良好等。

　　二、單克隆抗體的制備

　　1975年Kohler和Milstein發(fā)現(xiàn)將小鼠骨髓瘤細(xì)胞與和綿羊紅細(xì)胞免疫的小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行融合，形成的雜交瘤細(xì)胞既可產(chǎn)生抗體，又可無(wú)性繁殖，從而創(chuàng)立了單克隆抗體雜交瘤技術(shù)。這一技術(shù)上的突破使血清學(xué)的研究進(jìn)入了一個(gè)高度精確的新紀(jì)元。

　　免疫細(xì)胞化學(xué)的 技術(shù)關(guān)鍵之一是制備特異性強(qiáng)、親合力大、滴度高的特異性抗體，由于每種抗原都有幾個(gè)抗原決定簇，用它免疫動(dòng)物將產(chǎn)生對(duì)各個(gè)決定簇的抗體，即多克隆抗體。單克隆抗體則是由一個(gè)產(chǎn)生抗體的細(xì)胞與一個(gè)骨髓瘤細(xì)胞融合而形成的雜交廇細(xì)胞經(jīng)無(wú)性繁殖而來(lái)的細(xì)胞群所產(chǎn)生的，所以它的免疫球蛋白屬同一類(lèi)型，質(zhì)地純一，而且它是針對(duì)某一抗原決定簇的，因此特異性強(qiáng)，親合性也一致。單克隆抗體（McAb）的特性和常規(guī)血清抗體的特性比較見(jiàn)2-3。

表2—3 單克隆抗體（McAb）和常規(guī)免疫血清抗體的特性比較

　　單克隆抗體的制備方法如下。

　�。ㄒ唬﹦�(dòng)物的選擇與免疫

　　1．動(dòng)物的選擇 　純種BALB/C小鼠，較溫順，離窩的活動(dòng)范圍小，體弱，食量及排污較小，一般環(huán)境潔凈的實(shí)驗(yàn)室均能飼養(yǎng)成活。目前開(kāi)展雜交瘤技術(shù)的實(shí)驗(yàn)室多選用純種BALA/C小鼠。

　　2．免疫方案 　　選擇合適的免疫方案對(duì)于細(xì)胞融合雜交的成功，獲得高質(zhì)量的McAb至關(guān)重要。一般在融合前兩個(gè)月左右根據(jù)確立免疫方案開(kāi)始初次免疫，免疫方案應(yīng)根據(jù)抗原的特性不同而定。

　　（1）可溶性抗原免疫原性較弱，一般要加佐劑，半抗原應(yīng)先制備免疫原，再加佐劑。常用佐劑：福氏完全佐劑、福氏不完全佐劑。

　　初次免疫 抗原1～50μg加福氏完全佐劑皮下多點(diǎn)注射或脾內(nèi)注射（一般0.8～1ml,0.2ml/點(diǎn)）

　　↓3周后

　　第二次免疫 劑量同上，加福氏不完全佐劑皮下或ip（腹腔內(nèi)注射）（ip劑量不宜超過(guò)0.5ml）

　　↓3周后

　　第三次免疫 劑量同一，不加佐劑，ip（5～7天后采血測(cè)其效價(jià)）

　　↓2～3周

　　加強(qiáng)免疫，劑量50～500μg為宜，ip或iv（靜脈內(nèi)注射）

　　↓3天后

　　取脾融合

　　目前，用于可溶性抗原（特別是一些弱抗原）的免疫方案也不斷有所更新，如：①將可溶性抗原顆�；�或固相化，一方面增強(qiáng)了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改變抗原注入的途徑，基礎(chǔ)免疫可直接采用脾內(nèi)注射。③使用細(xì)胞因子作為佐劑，提高機(jī)體的免疫應(yīng)答水平，增強(qiáng)免疫細(xì)胞對(duì)抗原的反應(yīng)性。

　�。�2）顆�？乖�免疫性強(qiáng)，不加佐劑就可獲得很好的免疫效果。以細(xì)胞性抗原為例，免疫時(shí)要求抗原量為1～2×107個(gè)細(xì)胞。

　　初次免疫 1×107/0.5ml ip

　　↓2～3周后

　　第二次免疫 1×107/0.5ml ip

　　↓3周后

　　加強(qiáng)免疫（融合前三天）1×107/0.5ml ip或iv

　　↓

　　取脾融合

　�。ǘ�）細(xì)胞融合

　　1．細(xì)胞融合前準(zhǔn)備

　　（1）骨髓瘤細(xì)胞系的選擇：骨髓瘤細(xì)胞應(yīng)和免疫動(dòng)物屬于同一品系，這樣雜交融合率高，也便于接種雜交瘤在同一品系小鼠腹腔內(nèi)產(chǎn)生大量McAb。常用的骨髓瘤細(xì)胞系見(jiàn)表2-4。

表2-4用于融合試驗(yàn)的主要骨髓瘤細(xì)胞系

　　骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng)可用一般的培養(yǎng)液，如RPMI1640，DMEM培養(yǎng)基。小牛血清的濃度一般在10%～20%，細(xì)胞濃度以104～5×105/ml為宜，最大濃度不得超過(guò)106/ml。當(dāng)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的中期時(shí)，可按1：3～1：10的比例傳代。每3～5天傳代一次。細(xì)胞在傳代過(guò)程中，部分細(xì)胞可能有返祖現(xiàn)象，應(yīng)定期用8-氮鳥(niǎo)嘌呤進(jìn)行處理，使生存的細(xì)胞對(duì)HAT呈均一的敏感性。

　　（2）飼養(yǎng)細(xì)胞：在組織培養(yǎng)中，單個(gè)或少數(shù)分散的細(xì)胞不易生長(zhǎng)繁殖，若加入其它活細(xì)胞，則可促進(jìn)這些細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖，所加入的這種細(xì)胞數(shù)被稱(chēng)為飼養(yǎng)細(xì)胞。在制備McAb的過(guò)程中，許多環(huán)節(jié)　需要加飼養(yǎng)細(xì)胞，如在雜交瘤細(xì)胞篩選、克隆化和擴(kuò)大培養(yǎng)過(guò)程中，加入飼養(yǎng)細(xì)胞是十分必要的。常用的飼養(yǎng)細(xì)胞有：小鼠腹腔巨噬細(xì)胞（較為常用）、小鼠脾臟細(xì)胞或胸腺細(xì)胞。也有人用小鼠成纖維細(xì)胞系3T3經(jīng)放射線(xiàn)照射后作為飼養(yǎng)細(xì)胞。飼養(yǎng)細(xì)胞的量為一般為2×104或105細(xì)胞/孔。

　　2．細(xì)胞融合的步驟

　　（1）制備飼養(yǎng)細(xì)胞層：一般選用小鼠腹腔巨噬細(xì)胞。

　　與免疫小鼠相同品系的小鼠，常用BALB/C小鼠，6～10周

↓

　　拉頸 處死，浸泡在75%酒精內(nèi)，3～5min

　　↓

　　用無(wú)菌剪刀剪開(kāi)皮膚，暴露腹膜

　　↓

　　用無(wú)菌注射器注入5～6ml預(yù)冷的培養(yǎng)液（嚴(yán)禁刺破腸管）

　　↓

　　反復(fù)沖洗，吸出沖洗液

　　↓

　　沖洗液放入10ml離心管，1200rpm/分離5～6min

　　↓

　　用20%小牛血清（NCS）或胎牛血清（FCS）的培養(yǎng)液混懸，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至1×105/ml

　　↓

　　加入96孔板，100μl/孔

　　↓

　　放入37。c CO2孵箱培養(yǎng)

　�。�2）制備免疫脾細(xì)胞

　　最后一次加強(qiáng)免疫3天后小鼠拉頸處死

　　↓

　　無(wú)菌取脾臟，培養(yǎng)液洗 一次

　　↓

　　脾臟研碎，過(guò)不銹鋼篩網(wǎng)

　　↓

　　離心，細(xì)胞用培養(yǎng)液洗2次

　　↓

　　計(jì)數(shù)

　　↓

　　取108脾淋巴細(xì)胞懸液備用

　�。�3）制備骨髓瘤細(xì)胞

　　取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)骨髓瘤細(xì)胞離心

　　↓

　　用無(wú)血清培養(yǎng)液洗2次

　　↓

　　計(jì)數(shù)，取得×107細(xì)胞備用

　�。�4）融合

　�、賹⒐撬枇黾�(xì)胞與脾細(xì)胞按1：10或1：5的比例混合在一起，在50ml離心管中用無(wú)血清不完全培養(yǎng)液洗1次，離心，1200rpm,8min;棄上清，用吸管吸凈殘留液體，以免影響聚乙二醇（PEG）濃度。輕輕彈擊離心管底，使細(xì)胞沉淀略松動(dòng)。

　�、�90s內(nèi)加入37℃預(yù)溫的1ml 45%PEG（分子量4000）溶液，邊加邊輕微搖動(dòng)。37℃水浴作用90s。

　　③加37。C預(yù)溫的不完全培養(yǎng)液以終止PEG作用，每隔2min分別加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml。

　�、茈x心，800rpm, 6min。

　�、莩渖锨�，用含20%小牛血清HAT選擇培養(yǎng)液重懸。

　　⑥將上述細(xì)胞，加到已有飼養(yǎng)細(xì)胞層的96孔板內(nèi)，每孔加100μl。一般一個(gè)免疫脾臟可接種4塊96孔板。

　�、邔⑴囵B(yǎng)板置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

　�。ㄈ�）選擇雜交瘤細(xì)胞及抗體檢測(cè)

　　1．HAT選擇雜交瘤細(xì)胞　　　脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞經(jīng)PEG處理后，形成多種細(xì)胞的混合體，只有脾細(xì)胞與骨髓細(xì)胞形成的雜交瘤細(xì)胞才有意義。在HAT選擇培養(yǎng)液中培養(yǎng)時(shí)，由于骨髓瘤細(xì)胞缺乏胸苷激酶或次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤核糖轉(zhuǎn)移酶，故不能生長(zhǎng)繁殖，而雜交瘤細(xì)胞具有上述兩種酶，在HAT選擇培養(yǎng)液可以生長(zhǎng)繁殖。

　　在用HAT選擇培養(yǎng)1～2天內(nèi)，將有大量瘤細(xì)胞死亡，3～4天后瘤細(xì)胞消失，雜交細(xì)胞形成小集落，HAT選擇培養(yǎng)液維持7～10天后應(yīng)換用HT培養(yǎng)液，再維持2周，改用一般培養(yǎng)液。在上述選擇培養(yǎng)期間，雜交瘤細(xì)胞布滿(mǎn)孔底1/10面積時(shí)，即可開(kāi)始檢測(cè)特異性抗體，篩選出所需要的雜交瘤細(xì)胞系。在選擇培養(yǎng)期間，一般每2～3天換一半培養(yǎng)液。

　　2．抗體的檢測(cè)　　 檢測(cè)抗體的方法應(yīng)根據(jù)抗原的性質(zhì)、抗體的類(lèi)型不同，選擇不同的篩選方法，一般以快速、簡(jiǎn)便、特異、敏感的方法為原則。

　　常用的方法有：（1）放射免疫測(cè)定（RIA）可用于可溶性抗原、細(xì)胞McAb的檢測(cè)。（2）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）可用于可溶性抗原、細(xì)胞和病毒等McAb的檢測(cè)。（3）免疫熒光試驗(yàn)適合于細(xì)胞表面抗原的McAb的檢測(cè)。（4）其它如間接血凝試驗(yàn)、細(xì)胞毒性試驗(yàn)、旋轉(zhuǎn)粘附雙層吸附試驗(yàn)等。

　�。ㄋ模╇s交瘤的克隆化

　　雜交瘤克隆化一般是指將抗體陽(yáng)性孔進(jìn)行克隆化。因?yàn)榻?jīng)過(guò)HAT篩選后的雜交瘤克隆不能保證一個(gè)孔內(nèi)只有一個(gè)克隆。在實(shí)際工作中，可能會(huì)有數(shù)個(gè)甚至更多的克隆，可能包括抗體分泌細(xì)胞、抗體非分泌細(xì)胞、所需要的抗體（特異性抗體）分泌細(xì)胞和其它無(wú)關(guān)抗體的分泌細(xì)胞。要想將這些細(xì)胞彼此分開(kāi)就需要克隆化�？寺』�的原則是，對(duì)于檢測(cè)抗體陽(yáng)性的雜交克隆盡早進(jìn)行克隆化，否則抗體分泌的細(xì)胞會(huì)被抗體非分泌的細(xì)胞所抑制，因?yàn)榭贵w非分泌細(xì)胞的生長(zhǎng)速度比抗體分泌的細(xì)胞生長(zhǎng)速度快，二者競(jìng)爭(zhēng)的結(jié)果會(huì)使抗體分泌的細(xì)胞丟失。即使克隆化過(guò)的雜交瘤細(xì)胞也需要定期的再克隆，以防止雜交瘤細(xì)胞的突變或染色體丟失，從而喪失產(chǎn)生抗體的能力。

　　克隆化的方法很多，最常用的是有限稀釋法和軟瓊脂平板法。

　　1．有限稀釋法克隆

　　（1）克隆前1天制備飼養(yǎng)細(xì)胞層（同細(xì)胞融合）。

　　2）將要克隆的雜交瘤細(xì)胞從培養(yǎng)孔內(nèi)輕輕吹干，計(jì)數(shù)。

　�。�3）調(diào)整細(xì)胞為3～10個(gè)細(xì)胞/ml。

　�。�4）取頭天準(zhǔn)備的飼養(yǎng)細(xì)胞層的細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入稀釋細(xì)胞100μl。孵育于37℃、5%CO2孵箱中。

　�。�5）在第7天換液，以后每2～3天換液1次。

　�。�6）8～9天可見(jiàn) 細(xì)胞克隆形成，及時(shí)檢測(cè)抗體活性。

　　（7）將陽(yáng)性孔的細(xì)胞移至24孔板中擴(kuò)大培養(yǎng)。

　�。�8）每個(gè)克隆應(yīng)盡快凍存。

　　2．軟瓊脂培養(yǎng)法克隆

　　（1）軟瓊脂的配制：含有20%NCS（小牛血清）的2倍濃縮的RPMI1640。

　　①1%瓊脂水溶液：高壓滅菌，42℃預(yù)熱。

　�、�0.5%瓊脂：由1份1%瓊脂加1份含20%小牛血清的2倍濃縮的RPMI1640配制而成。置42℃保溫。

　　（2）用上述0.5%瓊脂液（含有飼養(yǎng)細(xì)胞）15ml傾注于直徑為9cm的平皿中，在室溫中待凝固后作為基底層備用。

　�。�3）按100/ml，500/ml或5000/ml等濃度配制需克隆的細(xì)胞懸液。

　�。�4）1ml 0.5%瓊脂液（42℃預(yù)熱）在室溫中分別與1ml不同濃度的細(xì)胞懸液相混合。

　　（5）混勻后立傾注于瓊脂基底層上，在室溫中10min，使其凝固，孵育于37℃、5%CO2孵箱中。

　�。�6）4～5天 后即可見(jiàn)針尖大小白色克隆，7～10天后，直接移種至含飼養(yǎng)細(xì)胞的24孔中進(jìn)行培養(yǎng)。

　�。�7）檢測(cè)抗體，擴(kuò)大培養(yǎng)，必要是地再克隆化。

　�。ㄎ澹╇s交瘤細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇

　　1．雜交瘤細(xì)胞的凍存　　 及時(shí)凍存原始孔的雜交瘤細(xì)胞每次克隆化得到的亞克隆細(xì)胞是十分重要的。因?yàn)樵跊](méi)有建立一個(gè)穩(wěn)定分泌抗體的細(xì)胞系的時(shí)候，細(xì)胞的培養(yǎng)過(guò)程中隨時(shí)可能發(fā)生細(xì)胞的污染、分泌抗體能力的喪失等等。如果沒(méi)有原始細(xì)胞的凍存，則可因上述意外而前功盡棄。

　　雜交瘤細(xì)胞的凍存方法同其他細(xì)胞系的凍存方法一樣，原則上細(xì)胞應(yīng)在每支安瓿含1×106以上，但對(duì)原始孔的雜交瘤細(xì)胞可以因培養(yǎng)環(huán)境不同而改變，在24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，當(dāng)長(zhǎng)滿(mǎn)孔底時(shí)，一孔就可以裝一支安瓿凍存。

　　細(xì)胞凍存液：50%小牛血清；40%不完全培養(yǎng)液；10%DMSO（二甲基亞砜）。

　　凍存液最好預(yù)冷，操作動(dòng)作輕柔、迅速。凍存時(shí)從室溫可立即降至0℃后放入-70℃超低溫冰箱，次日轉(zhuǎn)入液氮中。也可用細(xì)胞凍存裝置進(jìn)行凍存。凍存細(xì)胞要定期復(fù)蘇，檢查細(xì)胞的活性和分泌抗體的穩(wěn)定性，在液氮中細(xì)胞可保存數(shù)年或更長(zhǎng)時(shí)間。

　　2．細(xì)胞復(fù)蘇方法 　將玻璃安瓿自液氮中小心取出，放37℃水浴中，在1min內(nèi)使凍存的細(xì)胞解凍，將細(xì)胞用完全培養(yǎng)液洗滌兩次，然后移入頭天已制備好的飼養(yǎng)層細(xì)胞的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，置37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞形成集落時(shí)，檢測(cè)抗體活性。

　�。�六）單克隆抗體的大量生產(chǎn)

　　大量生產(chǎn)單克隆抗體的方法主要有兩種：

　�。�1）體外使用旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)管大量培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞，從一清液中獲取單克隆抗體。但此方法產(chǎn)量低，一般培養(yǎng)液內(nèi)抗體含量為10～60μg/ml,如果大量生產(chǎn)，費(fèi)用較高。

　�。�2）體內(nèi)接種雜交瘤細(xì)胞，制備腹水或血清。

　�、賹�(shí)體瘤法：對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雜交瘤細(xì)胞按1～3×107/ml接種于小鼠背部皮下，每處注射0.2ml,共2～4點(diǎn)。待腫瘤達(dá)到一定大小后（一般10～20天）則可采血，從血清中獲得單克隆 抗體的含量可達(dá)到1～10mg/ml。但采血量有限。

　　②腹水的制備：常規(guī)是先腹腔注射0.5ml Pristane 降植烷或液體石蠟于BALB/C鼠，1～2周后腹腔注射1×106個(gè)雜交瘤細(xì)胞，接種細(xì)胞7～10天后可產(chǎn)生腹水，密切觀(guān)察動(dòng)物的健康狀況與腹水征象，待腹水盡可能多，而小鼠頻于死亡之前，處死小鼠，用滴管將腹水吸入試管中，一般一只小鼠可獲5～10ml腹水。也可用注射器抽提腹水，可反復(fù)收集數(shù)次。腹水中單克隆抗體含量可達(dá)到5～10mg/ml，這是目前最常用的方法，還可將腹水中細(xì)胞凍存起來(lái)，復(fù)蘇后轉(zhuǎn)種小鼠腹腔則產(chǎn)生腹水塊、量多。

　�。ㄆ撸﹩慰寺】贵w的鑒定

　　對(duì)制備的McAb進(jìn)行系統(tǒng)的鑒定是十分必要的，應(yīng)做下述幾個(gè)方面的鑒定：

　　1．抗體特異性的鑒定 　　除用免疫原（抗原）進(jìn)行抗體的檢測(cè)外，還應(yīng)該用與其抗原成分相關(guān)的其它抗原進(jìn)行交叉試驗(yàn)，方法可用ELISA、IFA法。例如：①制備抗黑色素瘤細(xì)胞的McAb，除用黑色素瘤細(xì)胞反應(yīng)外，還應(yīng)該用其它臟器的腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞進(jìn)行交叉反應(yīng)，以便挑選腫瘤特異性或腫瘤相關(guān)抗原的單克隆抗體。②制備抗重組的細(xì)胞因子的單克隆抗體，應(yīng)首先考慮是否與表達(dá)菌株的蛋白有交叉反應(yīng)，其次是與其它細(xì)胞因子間有無(wú)交叉。

　　2．McAb的Ig類(lèi)與亞類(lèi)的鑒定　　一般在用酶標(biāo)或熒光素標(biāo)記的第二抗體進(jìn)行篩選時(shí)已經(jīng)基本上確定了抗體的Ig類(lèi)型。如果用的是酶標(biāo)或熒光素標(biāo)記的兔抗鼠IgG或IgM，則檢測(cè)出來(lái)的抗體一般是IgG類(lèi)或IgM類(lèi)。至于亞類(lèi)則需要用標(biāo)準(zhǔn)抗亞類(lèi)血清系統(tǒng)作雙擴(kuò)或夾心ELISA來(lái)確定。在作雙擴(kuò)試驗(yàn)時(shí)，如加入適量的PEG（3%），更有利于沉淀線(xiàn)的形成。

　　3．McAb中和活性的鑒定　　　用動(dòng)物或細(xì)胞的保護(hù)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定McAb的生物學(xué)活性。例如，如果確定抗病毒McAb的中和活性，則可用抗體和病毒同時(shí)接種于易感的動(dòng)物或敏感的細(xì)胞，來(lái)觀(guān)察動(dòng)物或細(xì)胞是否得到抗體的保護(hù)。

　　4．McAb識(shí)別抗原表位的鑒定　　用競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)，測(cè)相加指數(shù)的方法，測(cè)定McAb所識(shí)別抗原位點(diǎn)，來(lái)確定McAb的識(shí)別的表位是否相同。

5．McAb親合力的鑒定　 用ELISA或RIA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)來(lái)確定McAb與相應(yīng)抗原結(jié)合的親合力。

 

ELISA

ELISA是酶聯(lián)接免疫吸附劑測(cè)定 Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay 的簡(jiǎn)稱(chēng)。它是繼免疫熒光和放射免疫技術(shù)之后發(fā)展起來(lái)的一種免疫酶技術(shù)。此項(xiàng)技術(shù)自70年代初問(wèn)世以來(lái)，發(fā)展十分迅速，目前已被廣泛用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)科學(xué)的許多領(lǐng)域。

　　一　原理

　　ELISA是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，將抗原、牽9體的特異性反應(yīng)與酶對(duì)底物的高效催化作用相結(jié)合起來(lái)的一種敏感性很高的試驗(yàn)技術(shù)。由于抗原、抗體的反應(yīng)在一種固相載體──聚苯乙烯微量滴定板的孔中進(jìn)行，每加入一種試劑孵育后，可通過(guò)洗滌除去多余的游離反應(yīng)物，從而保證試驗(yàn)結(jié)果的特異性與穩(wěn)定性。在實(shí)際應(yīng)用中，通過(guò)不同的設(shè)計(jì)，具體的方法步驟可有多種。即:用于檢測(cè)抗體的間接法圖a、用于檢測(cè)抗原的雙抗體夾心法圖b以及用于檢測(cè)小分子抗原或半抗原的抗原競(jìng)爭(zhēng)法等等。比較常用的是ELISA雙抗體夾心法及ELISA間接法。

　　二　操作步驟

　　方法一　用于檢測(cè)未知抗原的雙抗體夾心法:

　　1.　包被：用0.05M PH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1～10μg／ml。在每個(gè)聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0.1ml，4℃過(guò)夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。簡(jiǎn)稱(chēng)洗滌，下同。

　　2.　加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37℃孵育1小時(shí)。然后洗滌。同時(shí)做空白孔，陰性對(duì)照孔及陽(yáng)性對(duì)照孔。

　　3.　加酶標(biāo)抗體：于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體經(jīng)滴定后的稀釋度0.1ml。37℃孵育0.5～1小時(shí)，洗滌。

　　4.　加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加入臨時(shí)配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分鐘。

　　5.　終止反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.05ml。

　　6.　結(jié)果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀(guān)察結(jié)果：反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽(yáng)性程度越強(qiáng)，陰性反應(yīng)為無(wú)色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺，以“+”、“-”號(hào)表示。也可測(cè)O·D值：在ELISA檢測(cè)儀上，于450nm若以ABTS顯色，則410nm處，以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔O·D值，若大于規(guī)定的陰性對(duì)照OD值的2.1倍，即為陽(yáng)性。

　　方法二　用于檢測(cè)未知抗體的間接法：

　　　　　　用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1～10μg／ml，
每孔加0.1ml，4℃過(guò)夜。次日洗滌3次。

　　　　　　　　　　　　　　↓

　　　　　　加一定稀釋的待檢樣品未知抗體0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔
中,置37℃孵育1小時(shí),洗滌。同時(shí)做空白、陰性及陽(yáng)性孔對(duì)照

　　　　　　　　　　　　　　↓

　　　　　　于反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)第二抗體抗抗體0.1ml，
37℃孵育30-60分鐘，洗滌,最后一遍用DDW洗滌。

　　　　　　　　　　　　　　↓

　　　　　　其余步驟同“雙抗體夾心法”的4、5、6。

　　三　試劑器材

　　1.　試劑

　　1　包被緩沖液PH9.6 0.05M碳酸鹽緩沖液:

　　　　　　Na?CO３　　　　1.59克

　　　　　　NaHCO３　 2.93克

　　　　　　加蒸餾水至1000ml

　　2　洗滌緩沖液PH7.4 PBS：0.15M

　　　　　　KH2PO4 　　　　　0.2克

　　　　　　Na2HPO４·12H2O　　2.9克

　　　　　　NaCl　　　　　　　8.0克

　　　　　　KCl　　　　　　　　0.2克

　　　　　　Tween-20　0.05％　0.5ml

　　　　　　加蒸餾水至1000ml

　　3　稀釋液：

　　　　　　　牛血清白蛋白BSA 0.1克

2.　器材:

　　1　聚苯乙烯塑料板簡(jiǎn)稱(chēng)酶標(biāo)板40孔或96孔，ELISA檢測(cè)儀，50μl及100μl加樣器，塑料滴頭，小毛巾，洗滌瓶。

　　2　小燒杯、玻璃棒、試管、吸管和量筒等。

　　3　4℃冰箱，37℃孵育箱。

　　四　注意事項(xiàng)

　　1.　正式試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)分別以陽(yáng)性對(duì)照與陰性對(duì)照控制試驗(yàn)條件，待檢樣品應(yīng)作一式二份，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。有時(shí)本底較高，說(shuō)明有非特異性反應(yīng)，可采用羊血清、兔血清或BSA等封閉。

　　2.　在ELISA中，進(jìn)行各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)條件的選擇是很重要的，其中包括:

　　1　固相載體的選擇：許多物質(zhì)可作為固相載體，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纖維素等。其形式可以是凹孔平板、試管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何種載體，在使用前均可進(jìn)行篩選：用等量抗原包被，在同一實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行反應(yīng)，觀(guān)察其顯色反應(yīng)是否均一性，據(jù)此判明其吸附性能是否良好。

　�。�2 包被抗體或抗原的選擇：將抗體或抗原吸附在固相載體表面時(shí)，要求純度要好,吸附時(shí)一般要求PH在9.0～9.6之間。吸附溫度，時(shí)間及其蛋白量也有一定影響,一般多采用4℃18～24小時(shí)。蛋白質(zhì)包被的最適濃度需進(jìn)行滴定：即用不同的蛋白質(zhì)濃度0.1、1.0和10μg／ml等進(jìn)行包被后，在其它試驗(yàn)條件相同時(shí)，觀(guān)察陽(yáng)性標(biāo)本的OD值。選擇OD值最大而蛋白量最少的濃度。對(duì)于多數(shù)蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)通常為1～10μg／ml。

　　3　酶標(biāo)記抗體工作濃度的選擇：首先用直接ELISA法進(jìn)行初步效價(jià)的滴定見(jiàn)酶標(biāo)記抗體部份。然后再固定其它條件或采取“方陣法”包被物、待檢樣品的參考品及酶標(biāo)記抗體分別為不同的稀釋度在正式實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)里準(zhǔn)確地滴定其工作濃度。

4   酶的底物及供氫體的選擇：對(duì)供氫體的選擇要求是價(jià)廉、安全、有明顯地顯色反應(yīng)，而本身無(wú)色。有些供氫體如OPD等有潛在的致癌作用，應(yīng)注意防護(hù)。有條件者應(yīng)使用不致癌、靈敏度高的供氫體，如TMB和ABTS是目前較為滿(mǎn)意的供氫體。底物作用一段時(shí)間后，應(yīng)加入強(qiáng)酸或強(qiáng)堿以終止反應(yīng)。通常底物作用時(shí)間，以10-30分鐘為宜。底物使用液必須新鮮配制，尤其是H2O2在臨用前加入。

 

 

免疫組化染色方法

 

SP法
1）脫蠟、水化；
2）PBS洗2～3次各5分鐘；
3）3%H2O2（80%甲醇）滴加在TMA上，室溫靜置10分鐘；
4）PBS洗2～3次各5分鐘； 5）抗原修復(fù)；
6）PBS洗2～3次各5分鐘；
7）滴加正常山羊血清封閉液,室溫20分鐘。甩去多余液體。
8）滴加Ⅰ抗50μl，室溫靜置1小時(shí)或者4℃過(guò)夜或者37℃1小時(shí)。
9）4℃過(guò)夜后需在37℃復(fù)溫45分鐘。
10）PBS洗3次各5分鐘；
11）滴加Ⅱ抗40～50μl，室溫靜置，或37℃1小時(shí)；
12）II抗中可加入0.05%的tween-20。
13）PBS洗3次各5分鐘；
14）DAB顯色5～10分鐘，在顯微鏡下掌握染色程度；
15）PBS或自來(lái)水沖洗10分鐘；
16）蘇木精復(fù)染2分鐘，鹽酸酒精分化；
17）自來(lái)水沖洗10～15分鐘；
18）脫水、透明、封片、鏡檢。

 

SABC法
1脫蠟、水化。
2PBS洗兩次各5分鐘。
3用蒸餾水或PBS配置新鮮的3%H2O2，室溫封閉5～10分鐘，蒸餾水洗3次。
4抗原修復(fù)。
5PBS洗5分鐘。 
6滴加正常山羊血清封閉液，室溫20分鐘。甩去多余液體。
7滴加Ⅰ抗,室溫1小時(shí)或者4℃過(guò)夜或者37℃1小時(shí)（4℃過(guò)夜后在37℃復(fù)溫45分鐘）。
8PBS洗三次每次2分鐘。
9滴加生物素化二抗,20℃～37℃20分鐘。
10PBC洗3次每次2分鐘。
11滴加試劑SABC，20℃～37℃20分鐘。

12PBS洗4次每次5分鐘。
13DAB顯色：DAB顯色試劑盒或者自配顯色劑顯色（鏡下掌握顯色程度）。
14蒸餾水洗。蘇木素復(fù)染2分鐘、鹽酸酒精分化。 
15脫水、透明、封片、鏡檢。

 

 

常用抗原修復(fù)方法

 

用于福爾馬林固定的石蠟包埋組織切片：

 

1）抗原熱修復(fù)  可根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的具體條件，選用微波爐抗原修復(fù)、高壓鍋抗原修復(fù)或水浴高溫抗原修復(fù)�？乖瓱嵝迯�(fù)可選用各種緩沖液，如TBS、PBS、重金屬鹽溶液等，但實(shí)驗(yàn)證明，以0.01M枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0）效果最好。請(qǐng)選用我公司提供的ZLI-9064 枸櫞酸鹽緩沖液（粉劑）配制，取該粉劑一包溶于1000ml的蒸餾水中，混勻，其pH值在6.0 ± 0.1，如因蒸餾水本身造成的pH值偏差，請(qǐng)自行調(diào)整。
（1）高壓熱修復(fù)  切片脫蠟至水。將1500ml~3000ml的0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液（pH6.0，工作液）或0.001M EDTA（pH8.0）注入不銹鋼壓力鍋中加熱至沸騰。切片置于金屬架上，放入鍋內(nèi)，使切片位于液面以下，蓋鍋壓閥。當(dāng)壓力鍋開(kāi)始慢慢噴氣時(shí)（約加熱5~6分鐘后），計(jì)時(shí)1~2分鐘，然后將壓力鍋端離熱源，冷水沖至室溫后，取下氣閥，打開(kāi)鍋蓋，取出切片，蒸餾水洗后，PBS洗2分鐘×3，下接免疫組化染色步驟。

（2）煮沸熱修復(fù)  切片脫蠟至水后，放入盛有0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液（pH6.0，工作液）的容器中，并將此容器置于盛有一定數(shù)量自來(lái)水的大器皿中，電爐上加熱煮沸，從小容器的溫度到達(dá)92℃~98℃起開(kāi)始計(jì)時(shí)15~20分鐘，然后端離電爐，室溫冷卻20~30分鐘，蒸餾水沖洗，PBS洗，

（3）微波熱修復(fù)。切片脫蠟至水后，3％H2O2處理10分鐘，蒸餾水洗2分鐘×3。將切片放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液（工作液）的容器中，置微波爐內(nèi)加熱使容器內(nèi)液體溫度保持在92℃~98℃之間并持續(xù)10~15分鐘（注意：無(wú)論是使用醫(yī)用或家用微波爐，請(qǐng)根據(jù)具體機(jī)型酌情設(shè)置條件，務(wù)必滿(mǎn)足以上步驟中對(duì)溫度和時(shí)間的要求）。取出容器，室溫冷卻10~20分鐘（注意：不可將切片從緩沖液中取出冷卻，以便使蛋白能夠恢復(fù)原有的空間構(gòu)型）。PBS洗，下接免疫組化染色步驟。適用的抗原有：AR，Bax，Bcl-2，C-fos，X-jun，C-kit，C-myc，E-cadherin，Chromogranin A，Cyclin，ER，Heat shock protein，HPV，Ki-67，MDMZ，p53，p34，p16，p15，P-glycoprotein，PKC，PR，PCNA，ras，Rb，TopoismeraseⅡ等。

2）酶消化方法  常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前預(yù)熱至37℃，切片也預(yù)熱至37℃，消化時(shí)間約為5~30分鐘（胰酶的最終濃度可以根據(jù)使用者的要求進(jìn)行調(diào)整，濃度范圍可以從0.05%至0.25%）； 胃蛋白酶消化37℃時(shí)間為30分鐘。皂素（Saponin）：一般使用濃度為2~10mg/ml的saponin溶液，消化時(shí)間為室溫孵育30分鐘。 適用于被固定遮避的抗原，其中有：Collagen，Complement，Cytokeratin，C-erB-2，GFAP，LCA，LN等。