一.熒光強度與溶液濃度的關系

    熒光是由物質吸收光能后發(fā)射而出，因此，溶液的熒光強度 F 和溶液吸收光能的程度以及物質的熒光頻率有關：

                 F ∝（I₀-I_t）→ F = K^’（I₀-I_t）                          (2)

K^’ 為常數(shù)，取決于熒光物質的量子效率F，根據(jù)L—B定律：

所以   F = K’ ( I₀-I₀10^-ebc) = K’ I₀ ( 1-10^-ebc)  = K’ I₀ ( 1-e^-2.303ebc )   (3)

    將式中 e^-2.303ebc 展開，得

   (4)

    當 2.303ebC£ 0.05 時(濃度很小，溶液較稀時)，上式括號內第一項以后的各項均可忽略不計，所以：   

F = K’I₀2.303ebc                        （5）

  對于一熒光物質的稀溶液，當 I₀ 及 b 一定時，

F=K·c                         （6）

     即在低濃度（2.303ebc £ 0.05）時，溶液的熒光強度與熒光物質的濃度呈（線性）正比關系。

二. 定量分析方法

 1. 工作曲線法：

    配制一系列濃度梯度的待測物的標準溶液，同空白溶液，使樣經過相同的處理之后分別測定熒光強度：F_s、F₀、F_x，然后作（ F_s - F₀）— c 曲線，根據(jù)（F_x–F₀)，從工作曲線上求得待測物的濃度（或含量）。

 2. 直接比較法 ：

    如果熒光物質溶液的工作曲線通過原點，就可選擇其線性范圍，用直接比較法進行測定：     

       F_s¯F₀ = Kc_{S ，}   F_x¯F₀ = Kc_x                                 （7）

三. 影響熒光強度的外界因素

 1.  激發(fā)光源：一般選用l_ex 最大

    但對某些易感光、易分解的熒光物質，盡量采用長波長，低 I₀ 及短時間光照

 2.  溫度：大多數(shù)分子在溫度升高時，分子與分子之間，分子與溶劑分子之間的碰撞頻率升高，非輻射能量轉移過程升高，F 降低，因此，降低溫度，有利于提高 F 。

 3.  溶液的 pH：帶有酸性或堿性環(huán)狀取代基的芳香組化合物的熒光一般都與 pH 值有關，有些化合物在離子狀態(tài)時不顯熒光。為此，在用熒光強度進行定量測定時，嚴格控制溶液 pH值是非常重要的。

4. 溶劑：對π

—π共軛的熒光物質

在極性溶劑中，∆E 減小↓→ 躍遷幾率升高↑ → F↑（波長長移）

溶劑粘度 ↓ → F↓

5. 內濾：當熒光波長與熒光物質或其它物質的吸收峰相重疊時，將發(fā)生自吸收使熒光物質的熒光強度下降，此現(xiàn)象稱 “內濾” 。

6. 散射光的影響（溶劑的二種散射）

（1）瑞利散射光：物質（溶劑或其它分子）分子吸收光能后，躍遷到基態(tài)的較高振動能級，在極短時間（10^-12s）返回到原來的振動能級并發(fā)出和原來吸收光相同波長的光，這種光稱為瑞利散射光。

（2）拉曼散射光：物質分子吸收光能后，若電子返回到比原來能極稍高（或稍低）的振動能級而發(fā)射的光稱為拉曼散射光。

    瑞利散射光波長與激發(fā)光波長相同，拉曼散射與激發(fā)光波長不同，而熒光物質的熒光波長與激發(fā)光波長無關，因此可以通過選擇適當?shù)募ぐl(fā)波長將拉曼散射光與熒光分開。

7. 熒光熄滅劑的影響：

    熒光熄滅：熒光物質分子與溶液中其它物質分子之間作用導致熒光強度降低的現(xiàn)象。

    熒光熄滅劑：引起熒光熄滅的物質。

如：X^-，重金屬離子、O₂  、硝基化物質、重氮化合物等。

    尤其是溶液中的溶解氧能引起幾乎所有的熒光物質產生不同程度的熒光熄滅現(xiàn)象，因此，在較嚴格的熒光實驗中必須除O₂ 。

8. 表面活性劑的影響：提高熒光強度。