無(wú)菌室的要求：

1、需要建立無(wú)菌室管理制度。

2、保持良好的衛(wèi)生：相對(duì)濕度40%---60%，溫度20—22 ℃，最好安裝空調(diào)。

3、無(wú)菌室不得進(jìn)行其他工作，非操作所使用的物件一律不得放入，檢后的余樣不得存放。

4、紫外燈的使用期限一般為300小時(shí)，要記錄使用時(shí)間，到期更換。

無(wú)菌操作及要求

以菌落總數(shù)、大腸菌群為例演示無(wú)菌實(shí)驗(yàn)流程

對(duì)實(shí)驗(yàn)臺(tái)、手、檢驗(yàn)用具進(jìn)行消毒（保證無(wú)菌環(huán)境和無(wú)菌實(shí)驗(yàn)用品），微生物的理想環(huán)境是無(wú)菌，但是更應(yīng)該做好防護(hù)，保護(hù)自己。防護(hù)衣服，口罩手套必須佩帶。

對(duì)實(shí)驗(yàn)的臺(tái)面進(jìn)行擦拭消毒，一般用75%乙醇或新潔爾滅溶液。

為保持無(wú)菌的進(jìn)行，對(duì)手心手腕這些容易殘留細(xì)菌的部位進(jìn)行消毒處理。

實(shí)驗(yàn)臺(tái)上面的藥品、盛裝樣品的盒子等實(shí)驗(yàn)用工具要進(jìn)行消毒處理。

實(shí)驗(yàn)前對(duì)培養(yǎng)基的檢查、無(wú)菌條件下稱樣

1）實(shí)驗(yàn)前檢查大腸菌群培養(yǎng)基的量、導(dǎo)氣管內(nèi)是否有氣泡。

2）開(kāi)啟超凈臺(tái)風(fēng)機(jī)、在無(wú)菌、空氣緩慢流動(dòng)狀態(tài)下工作。

3）進(jìn)行無(wú)菌稱樣，這一步其實(shí)最好是要佩帶手套的。

4）接種針滅菌

5）接菌試管口滅菌

6）取菌

在接種或向培養(yǎng)皿內(nèi)倒培養(yǎng)基時(shí)，試管口或瓶壁外面不要接觸皿底，試管或瓶口應(yīng)傾斜一下在火焰上通過(guò)。

總結(jié)

微生物實(shí)驗(yàn)室工作人員，必須有嚴(yán)格的無(wú)菌觀念，許多實(shí)驗(yàn)要求在無(wú)菌的條件下進(jìn)行，主要原因：

一是防止試驗(yàn)操作中人為污染樣品；

二是保證工作人員安全，防止檢出的致病菌由于操作不當(dāng)造成個(gè)人污染。

要求如下：

無(wú)菌室使用與管理要求

1．工作室應(yīng)矮小、平整，面積小，高2.2-2.3米，內(nèi)部裝修應(yīng)平整、光滑，無(wú)凹凸不平或棱角等，四壁及屋頂應(yīng)用不透水之材質(zhì)，便于擦洗及殺菌。

2．室內(nèi)采光面積大，從室外應(yīng)能看到室內(nèi)情況。

3．為保證無(wú)菌室的潔凈，無(wú)菌室周圍需設(shè)緩沖走廊，走廊旁再設(shè)緩沖間，其面積可小于無(wú)菌室。

4．無(wú)菌室、緩沖走廊及緩沖間均設(shè)有日光燈及供消毒空氣用紫外燈，殺菌紫外燈離工作臺(tái)以1米為宜 ，其電源開(kāi)關(guān)均應(yīng)設(shè)在室外。

5．無(wú)菌室與緩沖間進(jìn)出口應(yīng)設(shè)拉門(mén)，門(mén)與窗平齊，門(mén)縫要封緊，兩門(mén)應(yīng)錯(cuò)開(kāi)，以免空氣對(duì)流造成污染。

6．無(wú)菌室的使用與管理

（1） 無(wú)菌室應(yīng)保持清潔整齊，室內(nèi)僅存放必須的檢驗(yàn)用具如酒精燈、酒精棉、火柴、鑷子、接種針、接種環(huán)等。不要放與檢測(cè)無(wú)關(guān)的物品

（2） 室內(nèi)檢驗(yàn)用具及凳桌等保持固定位置，不隨便移動(dòng)。

（3） 每2-3周用2%石炭酸水溶液擦拭工作臺(tái)、門(mén)、窗、桌、椅及地面，然后用3%石炭酸水溶液噴霧消毒空氣，最后紫外燈殺菌半小時(shí)。

（4） 定期檢查室內(nèi)空氣無(wú)菌狀況，細(xì)菌數(shù)應(yīng)控制在10個(gè)以下，發(fā)現(xiàn)不符合要求時(shí)，應(yīng)立即徹底消毒滅菌。無(wú)菌室無(wú)菌程度的測(cè)定方法：取普通肉湯瓊脂平板、改良馬丁培養(yǎng)基平板各3個(gè)（平板直徑均9厘米），置無(wú)菌室各工作位置上，開(kāi)蓋曝露半小時(shí)，然后倒置進(jìn)行培養(yǎng)，測(cè)細(xì)菌總數(shù)應(yīng)置37℃溫箱培養(yǎng)48小時(shí)；測(cè)霉菌數(shù)則應(yīng)置27℃溫箱培養(yǎng)5天。細(xì)菌、霉菌總數(shù)均不得超過(guò)10個(gè)為合格 。

（5） 無(wú)菌室殺菌前，應(yīng)將所有物品置于操作之部位（待檢物例外），然后打開(kāi)紫外燈殺菌30分鐘，時(shí)間一到，關(guān)閉紫外燈待用。

（6） 進(jìn)入無(wú)菌室前，必須于緩沖間更換消毒過(guò)的工作服、工作帽及工作鞋。

（7） 操作應(yīng)嚴(yán)格按照無(wú)菌操作規(guī)定進(jìn)行，操作中少說(shuō)話，不喧嘩，以保持環(huán)境的無(wú)菌狀態(tài)。

器材及場(chǎng)所的滅菌消毒

微生物檢驗(yàn)用器材及場(chǎng)所必須進(jìn)行滅菌或消毒處理，不同的對(duì)象采用不同的處理方法。

1． 高壓蒸汽滅菌: 工作服、口罩、稀釋液等，置高壓殺菌鍋內(nèi)，一般采用121℃滅菌半小時(shí),當(dāng)然不同的培養(yǎng)基有不同的要求,應(yīng)分別處理。

2． 火焰滅菌： 接種針、接種環(huán)等可直接火焰滅菌。

3． 高溫干燥滅菌： 各種玻璃器皿、注射器、吸管等，置于燥箱中160℃滅菌2小時(shí)。

4． 一 般消毒: 無(wú)菌室內(nèi)的凳、工作臺(tái)、試管架、天平、待檢物容器或包裝均無(wú)法進(jìn)行滅菌，必須用其他方法進(jìn)行消毒處理，采用2%石炭酸或來(lái)蘇兒水溶液擦拭消毒，工作人員的手也用此法進(jìn)行消毒。

5． 空氣的消毒： 開(kāi)啟紫外燈照射30-60分鐘 即可。

準(zhǔn)備工作

1． 先進(jìn)行無(wú)菌室空間的消毒，開(kāi)啟紫外燈30-60分鐘。

2． 檢驗(yàn)用的有關(guān)器材， 搬入無(wú)菌室前必須分別進(jìn)會(huì)滅菌消毒。

3． 操作人員必須將手清洗消毒，穿戴好無(wú)菌工作衣、帽和鞋，才能進(jìn)入無(wú)菌室。

4． 進(jìn)入無(wú)菌室后再一次消毒手部，然后才進(jìn)行檢驗(yàn)操作。

操作過(guò)程注意事項(xiàng)

1． 動(dòng)作要輕，不能太快，以免攪動(dòng)空氣增加污染；玻璃器皿也應(yīng)輕取輕放，以免破損污染環(huán)境。

2． 操作應(yīng)在近火焰區(qū)進(jìn)行。

3． 接種環(huán)、接種針等金屬器材使用前后均需灼燒，灼燒時(shí)先通過(guò)內(nèi)焰，使殘物烘干后再灼燒滅菌。

4． 使用吸管時(shí)，切勿用嘴直接吸、吹吸管，而必須用洗耳球操作。

5． 觀察平板時(shí)不好 開(kāi)蓋，如欲沾取菌落檢查時(shí)，必需靠近火焰區(qū)操作，平皿蓋也不能 大開(kāi)，而是上下蓋適當(dāng)開(kāi)縫。

6． 進(jìn)行可疑致病菌涂片染色時(shí)，應(yīng)使用夾子夾持玻片，切勿用手 直接拿玻片，以免造成污染，用過(guò)的玻片也應(yīng)置于消毒液中浸泡消毒，然后再洗滌。

7． 工作結(jié)束，收拾好工作臺(tái)上的樣品及器材，最后用消毒液擦拭工作臺(tái)。