┅┅加入1ml正己烷（或正庚烷），用渦旋儀渦動30s，再加入2ml復(fù)溶工作液（見配液6），用渦旋儀渦動1min充分混勻；（如出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，請于60℃水浴中加熱5min，再重復(fù)離心）；

┅┅除去上層有機(jī)相，取下層水相50µl用于分析。

九、檢測步驟

測定前應(yīng)須知：

1、使用之前將所有試劑和需用板條的溫度回升至室溫（20-25℃）。

2、使用之后立即將所有試劑放回2-8℃。

3、在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點(diǎn)。

4、在所有恒溫孵育過程中，避免光線照射，用蓋板膜封住微孔板。

 操作步驟：

1、將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，置于室溫（20-25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。

2、取出需要數(shù)量的微孔板，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。

3、洗滌工作液在使用前也需回溫。

4、編號：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號，每個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。

5、抗體工作液的稀釋：將抗體濃縮液用復(fù)溶工作液按照1：10體積比進(jìn)行稀釋（1份抗體濃縮液加入10份復(fù)溶工作液）。

6、加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本：加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50ml到對應(yīng)的微孔中，然后加入抗體工作液50ml/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中反應(yīng)30min。

7、洗板：小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌工作液（見配液7）250ml/孔，充分洗滌4－5次，每次間隔10s，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用未使用過的槍頭戳破）。

8、酶標(biāo)二抗工作液的稀釋：將酶標(biāo)二抗?jié)饪s液用復(fù)溶工作液按照1：10體積比進(jìn)行稀釋（1份酶標(biāo)二抗?jié)饪s液加入10份復(fù)溶工作液）。

9、加酶標(biāo)二抗：加入酶標(biāo)二抗100ml/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中反應(yīng)30min，取出重復(fù)洗板步驟7。

10、顯色：加入底物液A液50ml/孔，再加底物液B液50ml/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中反應(yīng)15min（見注意事項(xiàng)8）。

11、測定：加入終止液50ml/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測，請?jiān)?min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)），測定每孔OD值。(若無酶標(biāo)儀，則不加終止液用目測法可進(jìn)行判定)。

十、結(jié)果判定

結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光值與呋喃唑酮代謝物的含量成負(fù)相關(guān)。

1、用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)值比較即可得出其濃度范圍(ppb)。假設(shè)樣本1的吸光度值為0.310，樣本2的吸光度值為0.820，標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是：0ppb為2.104；0.05ppb為1.224；0.15ppb為0.859；0.45ppb為0.522； 1.35ppb為0.270；4.05ppb為0.129。則樣本1的濃度范圍是0.45ppb-1.35ppb再乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即可得出樣本中呋喃唑酮代謝物殘留的濃度范圍；樣本2的濃度范圍是0.15ppb-0.45ppb再乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即可得出樣本中呋喃唑酮代謝物殘留的濃度范圍。

2、定量分析

（1）百分吸光率的計(jì)算，標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值，再乘以100%，即

B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B0—0ppb標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算

以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以呋喃唑酮代謝物標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ppb）的半對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中呋喃唑酮代謝物的實(shí)際濃度。

若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計(jì)算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。（歡迎來電索取）

樣本稀釋倍數(shù)

肌肉、肝臟組織樣品稀釋倍數(shù)：2

奶樣樣品稀釋倍數(shù)：2

蜂蜜樣品的稀釋倍數(shù)：2

雞蛋樣品的稀釋倍數(shù)：2  

十一、檢測方法靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度

試劑盒靈敏度：0.05ppb

樣本最低檢測限：

組織、蜂蜜 ……………………………………………0.1ppb

雞蛋、奶樣………………………………………………0.1ppb

準(zhǔn)確度：

肌肉、肝臟組織 ……………………………… 75±15%

蜂蜜 …………………………………………… 90±15%

雞蛋 …………………………………………… 90±20%

奶樣………………………………………………… 90±10%

精密度：

試劑盒的變異系數(shù)均小于10%

十二、注意事項(xiàng)

1、室溫低于20℃或試劑及樣本沒有回到室溫（20-25℃）會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。

2、在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。

3、每加一種試劑前需要將其搖勻。

4、反應(yīng)終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。

5、不要使用過了有效日期的試劑盒；也不要使用過了有效期的試劑盒中的任何試劑，摻雜使用過了有效期的試劑盒會引起靈敏度的降低；不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。

6、儲存條件

保存試劑盒于2-8℃，不要冷凍，將不用的微孔板放進(jìn)自封袋重新密封。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。

7、試劑變質(zhì)的跡象

發(fā)色試劑有任何顏色表明發(fā)色劑變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度（450/630nm）值小于0.5（A450nm<0.5 ）時，表示試劑可能變質(zhì)。

8、在加入底物液A液和底物液B液后，一般顯色10-15min即可。若顏色較淺，可延長反應(yīng)時間到20min（或更長），但不得超過30min。反之，則減短反應(yīng)時間。

9、該試劑盒最佳反應(yīng)溫度為25℃，溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。

十三、貯藏條件及保存期

     貯藏條件：保存試劑盒于2~8℃。