1.1 流式細(xì)胞儀的基本概念　
 

  流式細(xì)胞儀（flow cytonletry，F(xiàn)CM）是對高速直線流動的細(xì)胞或生物微粒進(jìn)行快速定量測定和分析的儀器，主要包括樣品的液流技術(shù)、細(xì)胞的計(jì)數(shù)和分選技術(shù)，計(jì)算機(jī)對數(shù)據(jù)的采集和分析技術(shù)等。流式細(xì)胞儀以流式細(xì)胞術(shù)為理論基礎(chǔ)，是流體力學(xué)、激光技術(shù)、電子工程學(xué)、分子免疫學(xué)、細(xì)胞熒光化學(xué)和計(jì)算機(jī)等學(xué)科知識綜合運(yùn)用的結(jié)晶。流式細(xì)胞術(shù)是一種自動分析和分選細(xì)胞或亞細(xì)胞的技術(shù)。其特點(diǎn)是：測量速度快、被測群體大、可進(jìn)行多參數(shù)測量，即對同一個(gè)細(xì)胞做有關(guān)物理、生物化學(xué)特性的多參數(shù)測量，且在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有效。
 

1.2 流式細(xì)胞儀的發(fā)展簡史

 

  最早的流式細(xì)胞儀雛形誕生于1934年，Moldavan提出使懸浮的單個(gè)血紅細(xì)胞流過玻璃毛細(xì)管，在亮視野下用顯微鏡進(jìn)行計(jì)數(shù)，并用光電記錄裝置測量的設(shè)想。1953年Crosland-Taylor根據(jù)牛頓流體在圓形管中流動規(guī)律設(shè)計(jì)了流動室。其后又經(jīng)過Coulter、Parker & Horst、Kamentsky、Gohde、Fulwyler、Herzenberg等人的不斷改進(jìn)，設(shè)計(jì)了光電檢測設(shè)備和細(xì)胞分選裝置、完成了計(jì)算機(jī)與流式細(xì)胞儀的物理連接及多參數(shù)數(shù)據(jù)的記錄和分析、開創(chuàng)了細(xì)胞的免疫熒光染色及檢測技術(shù)、推廣流式細(xì)胞儀在臨床上的應(yīng)用。近20年來，隨著流式細(xì)胞儀及其檢測技術(shù)的日臻完善，人們越來越致力于樣品制備、細(xì)胞標(biāo)記、軟件開發(fā)等方面的工作，以擴(kuò)大FCM的應(yīng)用領(lǐng)域和使用效果。

  宋平根的《流式細(xì)胞術(shù)的原理和應(yīng)用》是迄今為止對流式細(xì)胞儀及其技術(shù)闡述的最為詳盡和透徹的中文著作。這本書非常詳細(xì)地介紹了流式細(xì)胞術(shù)的歷史、結(jié)構(gòu)、原理、技術(shù)指標(biāo)等，例舉了其在醫(yī)學(xué)和生物工程中的應(yīng)用，非常適合從事此方面專業(yè)研究的人。由于這本書是13年前出版的，所以基本上沒有涉及植物流式細(xì)胞儀檢測技術(shù)。此外對于只需要對流式細(xì)胞儀有些基本認(rèn)識的人士來說，這本書太復(fù)雜太深奧。謝小梅主要介紹了流式細(xì)胞儀在生物工程中的應(yīng)用。楊蕊概括了流式細(xì)胞儀的工作原理，簡單提及了流式細(xì)胞儀的應(yīng)用。本文在分析這三篇論著或文章的優(yōu)缺點(diǎn)后，用比較通俗的語言介紹了掌握流式細(xì)胞儀檢測技術(shù)必須了解的一些原理，并對目前市場上的主流型號進(jìn)行了客觀的性能概括。
 

2 流式細(xì)胞儀的工作原理和技術(shù)指標(biāo)
 

2.1 流式細(xì)胞儀工作原理　

  除電源外，流式細(xì)胞儀主要由四部分組成：流動室和液流系統(tǒng)：激光源和光學(xué)系統(tǒng)；光電管和檢測系統(tǒng)；計(jì)算機(jī)和分析系統(tǒng)，其中流動室是儀器的核心部件。這四大部件共同完成了信號的產(chǎn)生、轉(zhuǎn)換和傳輸?shù)娜蝿?wù)。
 

2.1.1 信號的產(chǎn)生、轉(zhuǎn)換和傳輸

  在壓力作用下，鞘液管中的鞘液被持續(xù)不斷地壓入流動室，形成一股穩(wěn)定地連續(xù)的液流，保證了樣本液穩(wěn)定地處于鞘液液流的軸線上，并以單個(gè)細(xì)胞形式直線通過激光照射區(qū)。激光照射區(qū)又稱測量區(qū)，是指液流與激光束垂直相交的點(diǎn)。當(dāng)細(xì)胞攜帶熒光素標(biāo)記物通過激光照射區(qū)時(shí)，產(chǎn)生代表細(xì)胞內(nèi)部不同物質(zhì)、不同波長的熒光信號，這些信號以細(xì)胞為中心，向空間360°立體角發(fā)射，產(chǎn)生散射光和熒光信號。散射光不依賴任何細(xì)胞樣品的制備技術(shù)，因此被稱為細(xì)胞的物理參數(shù)或固有參數(shù)。散射光又包括前向角散射和測向角散射。前向角散射與被測細(xì)胞直徑的平方密切相關(guān)，測向角散射光對細(xì)胞膜、胞質(zhì)、核膜的折射率更敏感，可提供有關(guān)細(xì)胞內(nèi)精細(xì)結(jié)構(gòu)和顆粒性質(zhì)的信息。熒光信號也有二種；一種是細(xì)胞自身在激光照射下發(fā)出的微弱熒光信號，另一種是經(jīng)過特異熒光素標(biāo)記后的細(xì)胞受激發(fā)照射后得到的熒光信號。在免疫分析中常要同時(shí)探測兩種以上波長的熒光信號，就采用二向色性反射鏡，或二向色性分光器，來有效地將各種熒光分開。

  經(jīng)熒光染色的細(xì)胞受到適合的光激發(fā)后產(chǎn)生的熒光是通過光電轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)變成電信號而進(jìn)行測量的。最常用的光電轉(zhuǎn)換器是光電倍增管（PMT）。從PMT輸出的電信號需要經(jīng)過放大后才能輸入分析儀器。流式細(xì)胞儀中一般備有兩類放大器。一類是線性放大器，其輸出信號與輸入信號成線性關(guān)系。線性放大器適用于在較小范圍內(nèi)變化的信號以及代表生物學(xué)線性過程的信號，如DNA測量等。另一類是對數(shù)放大器，其輸出信號和輸入信號之間成常用對數(shù)關(guān)系。在免疫學(xué)測量中常使用對數(shù)放大器。放大后的電信號被傳送到計(jì)算機(jī)，再經(jīng)模一數(shù)轉(zhuǎn)換器傳輸?shù)轿�機(jī)處理器形成數(shù)據(jù)文件，保存在計(jì)算機(jī)上。保存在計(jì)算機(jī)上的數(shù)據(jù)可在脫機(jī)后再進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。
 

2.1.2 流式細(xì)胞儀分選原理

  并不是所有的流式細(xì)胞儀都具有分選功能。流式細(xì)胞儀的分選功能是由細(xì)胞分選器來完成的。由噴嘴射出的液流柱在電信號作用下發(fā)生振動，斷裂形成均勻的小液滴。根據(jù)選定的某個(gè)參數(shù)由邏輯電路判明是否將被分選，而后由充電電路對選定細(xì)胞液滴充電，帶電液滴攜帶細(xì)胞通過靜電場而發(fā)生偏轉(zhuǎn)，落入收集器中。使用不同孔徑的噴孔及改變液流速度，可能會改變分選效果。從參數(shù)測定經(jīng)邏輯選擇再到脈沖充電需要一段延遲時(shí)間。精確測定延遲時(shí)間是決定分選質(zhì)量的關(guān)鍵，可根據(jù)具體要求進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。
 

2.1.3 數(shù)據(jù)的顯示和分析
  數(shù)據(jù)處理主要包括數(shù)據(jù)的顯示和分析。單參數(shù)直方圖是使用最多的圖形顯示形式，既可用于定性分析，又可用于定量分析。單參數(shù)直方圖是由X、Y二方向組成的二維平面圖。橫座標(biāo)X是所測的熒光或散射光的強(qiáng)度，用“道數(shù)”（Channel No．）來表示。選擇的放大器類型不同，標(biāo)度不同�？v座標(biāo)Y通常表示被測細(xì)胞的絕對數(shù)目。正常情況下，數(shù)據(jù)分析得到的圖形為具有一個(gè)或若干個(gè)峰的曲線圖。對曲線圖的解釋應(yīng)該具體問題具體分析。

  除直方圖外，數(shù)據(jù)顯示方式還包括二維點(diǎn)圖、二維等高圖、假三維圖和列表模式等。二維點(diǎn)圖也是比較常用的數(shù)據(jù)顯示類型。它顯示兩個(gè)獨(dú)立參數(shù)與細(xì)胞相對數(shù)之間的關(guān)系，也是二維平面圖，橫縱坐標(biāo)可以根據(jù)自己選定的被測參數(shù)自行決定，點(diǎn)的位置表明了細(xì)胞和顆粒具有的二個(gè)被測參數(shù)的數(shù)值。二維點(diǎn)圖所提供的信息量要大于單參數(shù)直方圖。

  數(shù)據(jù)分析的方法大體可分為參數(shù)法和非參數(shù)法兩大類。當(dāng)被檢測的生物學(xué)系統(tǒng)能夠用某種數(shù)學(xué)模型時(shí)則多使用參數(shù)方法。非參數(shù)分析法不用對顯示的圖像做任何假設(shè)，也不采用數(shù)學(xué)模型，分析程序可以很簡單，也可能很復(fù)雜。臨床醫(yī)學(xué)較常使用非參數(shù)分析法。
 

2.2 流式細(xì)胞儀性能的技術(shù)指標(biāo)

  流式細(xì)胞儀性能的技術(shù)指標(biāo)主要有熒光分辨率、熒光靈敏度、適用樣品濃度、分選純度等。熒光分辨率是指分辨兩個(gè)相鄰峰的最小距離，通常用變異系數(shù)（CV值）來表示�，F(xiàn)在市場上主流型號出廠時(shí)的熒光分辨率應(yīng)該小于2.0%。熒光靈敏度反映了儀器探測最小熒光光強(qiáng)的能力。一般用熒光微球上可測出的FITC的最少分子數(shù)來表示。目前儀器均可達(dá)到1000左右。儀器工作時(shí)樣品濃度一般在105～107細(xì)胞/ml。分析速度/分選速度是指流式細(xì)胞儀每秒種可分析或分選的顆粒數(shù)目。一般分析速度為5000～10000，分選速度控制在1000以下。

  流式細(xì)胞儀測量的數(shù)據(jù)是相對值，因此需要在使用前對系統(tǒng)進(jìn)行校準(zhǔn)或標(biāo)定。流式細(xì)胞儀的校準(zhǔn)有二個(gè)目的，即儀器的準(zhǔn)直調(diào)整和定量標(biāo)度。通常使用標(biāo)準(zhǔn)微球作為非生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)樣品，雞血紅細(xì)胞做為生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)樣品。