色譜分析法：

01

色譜法是一種分離分析方法。它利用樣品中各組分與流動相和固定相的作用力不同（吸附、分配、交換等性能上的差異），先將它們分離，后按一定順序檢測各組分及其含量的方法。

 

色譜法的分離原理：
02

當混合物隨流動相流經色譜柱時，就會與柱中固定相發(fā)生作用（溶解、吸附等），由于混合物中各組分物理化學性質和結構上的差異，與固定相發(fā)生作用的大小、強弱不同，在同一推動力作用下，各組分在固定相中的滯留時間不同，從而使混合物中各組分按一定順序從柱中流出。這種利用各組分在兩相中性能上的差異，使混合物中各組分分離的技術，稱為色譜法。

 

流動相：
03

色譜分離過程中攜帶組分向前移動的物質。

 

固定相：
04

色譜分離過程中不移動的具有吸附活性的固體或是涂漬在載體表面的液體。

 

色譜法的特點：
05

（1）分離效率高，復雜混合物，有機同系物、異構體。

（2）靈敏度高，可以檢測出μg.g-1(10-6)級甚至ng.g-1(10-9)級的物質量。

（3）分析速度快，一般在幾分鐘或幾十分鐘內可以完成一個試樣的分析。

（4）應用范圍廣，氣相色譜：沸點低于400℃的各種有機或無機試樣的分析。液相色譜：高沸點、熱不穩(wěn)定、生物試樣的分離分析。

（5）高選擇性:對性質極為相似的組分有很強的分離能力.。不足之處：被分離組分的定性較為困難。

 

色譜分析法的分類：
06

按兩相狀態(tài)分類，按操作形式分類，按分離原理分類。

 

按兩相狀態(tài)分類：
07

氣相色譜(Gas Chromatography,GC)，液相色譜(Liquid Chromatography, LC)，超臨界流體色譜(Supercritical Fluid Chromatography, SFC)。

氣相色譜：流動相為氣體(稱為載氣)。常用的氣相色譜流動相有N₂、H₂、He等氣體，按分離柱不同可分為：填充柱色譜和毛細管柱色譜；按固定相的不同又分為：氣固色譜和氣液色譜。

液相色譜：流動相為液體(也稱為淋洗液)。按固定相的不同分為：液固色譜和液液色譜。超臨界流體色譜：流動相為超臨界流體。

超臨界流體是一種介于氣體和液體之間的狀態(tài)。超臨界流體色譜法是集氣相色譜法和液相色譜法的優(yōu)勢而發(fā)展起來的一種新型的色譜分離分析技術，不僅能夠分析氣相色譜不宜分析的高沸點、低揮發(fā)性的試樣組分，而且具有比高效液相色譜更快的分析速率和更高的柱效率。

 

按操作形式分類：
08

柱色譜(Column Chromatography, CC):固定相裝在柱管內；包括填充柱色譜和毛細管柱色譜。紙色譜(Paper Chromatography, PC)固定相為濾紙；采用適當溶劑使樣品在濾紙上展開而進行分離。薄層色譜(Thin Layer Chromatography, TLC固定相壓成或涂成薄層；操作方法同紙色譜。

 

按分離原理分類：
09

吸附色譜(Absorption chromatography)；分配色譜(Partition Chromatography)；離子交換色譜(Ion Exchange Chromatography)；凝膠色譜(Gel Chromatography)。

 

色譜圖:
010

組分在檢測器上產生的信號強度對時間(t)所作的圖，由于它記錄了各組分流出色譜柱的情況，所以又叫色譜流出曲線。流出曲線的突起部分稱為色譜峰。

 

色譜保留值：
011

色譜保留值是色譜定性分析的依據，它體現了各待測組分在色譜柱上的滯留情況。在固定相中溶解性能越好，或與固定相的吸附性能越強的組分，在柱中的滯留時間越長，或者說將組分帶出色譜柱所需的流動相體積越大。所以保留值可以用保留時間和保留體積兩套參數來描述。

 

色譜圖上的色譜流出曲線可以說明什么問題：
012

根據色譜峰的數目，可判斷樣品中所含組分的最少個數；根據色譜峰的保留值進行定性分析；根據色譜峰的面積或峰高進行定量分析；根據色譜峰的保留值和區(qū)域寬度評價色譜柱的分離效能；根據兩峰間的距離，可評價固定相及流動相選擇是否合適。

 

分配比：
013

分配比是指，在一定溫度下，組分在兩相間分配達到平衡時的質量比。

 

在色譜流出曲線上，兩峰之間的距離主要由兩組分在兩相間的分配系數還是擴散速度決定？為什么？
014

分配系數。兩峰間的距離由熱力學因素決定，兩組分在兩相中分配系數差異越大，兩峰間的距離則相差越大，越容易被分離。而擴散速度是動力學因素，反映在色譜流出曲線上即為色譜峰的區(qū)域寬度（形狀）。

 

色譜理論需要解決的問題：
015

色譜分離過程的熱力學和動力學問題。影響分離及柱效的因素與提高柱效的途徑，柱效與分離度的評價指標及其關系。

 

組分保留時間為何不同?色譜峰為何變寬?
016

組分保留時間：色譜過程的熱力學因素控制；（組分和固定液的結構和性質）。色譜峰變寬：色譜過程的動力學因素控制；（兩相中的運動阻力，擴散作用）。塔板理論和速率理論分別從熱力學和動力學的角度闡述了色譜分離效能及其影響因素。

 

半經驗理論：
017

將色譜分離過程比擬作蒸餾過程，將連續(xù)的色譜分離過程分割成多次的平衡過程的重復（類似于蒸餾塔塔板上的平衡過程）。

 

塔板理論的特點：
018

塔板理論引入了塔板數和塔板高度作為柱效的衡量指標；不同物質在同一色譜柱上的分配系數不同，用有效塔板數和有效塔板高度作為衡量柱效能的指標時，應指明測定物質；柱效不能表示被分離組分的實際分離效果，當兩組分的分配系數K相同時，無論該色譜柱的塔板數多大，都無法分離。

 

塔板理論的不足：
019

塔板理論的基本假設不符合色譜柱的實際分離過程。塔板理論無法解釋同一色譜柱在不同的流動相流速下柱效不同的實驗結果，不能說明色譜峰為什么會展寬，同時未能指出影響柱效的因素及提高柱效的途徑和方法。

 

速率方程：
020

（也稱范第姆特方程式）：H =A+B/u+C·u，H：塔板高度；u：流動相的平均線速度(cm/s)。

A ─渦流擴散項 ：A與流動相性質、流動相速率無關。要減小A值，需要從提高固定相的顆粒細度和均勻性以及填充均勻性來解決。對于空心毛細管柱，A=0。固定相顆粒越小dp↓，填充的越均勻，A↓，H↓，柱效n↑。表現在渦流擴散所引起的色譜峰變寬現象減輕，色譜峰較窄。

B/u —分子擴散項 ：存在著濃度差，產生縱向擴散；擴散導致色譜峰變寬，H↑(n↓)，分離變差；分子擴散項與流速有關，流速↓，滯留時間↑，擴散↑；擴散系數：Dg ∝(M載氣)-1/2 ；M載氣↑，B值↓。

C ·u —傳質阻力項 ：dp↓， df↓, D ↑ ,可降低傳質阻力。

H-u曲線與最佳流速：
021

由于流速對這兩項完全相反的作用，流速對柱效的總影響使得存在著一個最佳流速值，即速率方程式中塔板高度對流速的一階導數有一極小值。以塔板高度H對應流速u作圖，曲線最低點的流速即為最佳流速。

 

速率理論的要點:
022

組分分子在柱內運行的多路徑與渦流擴散、濃度梯度所造成的分子擴散及傳質阻力使兩相間的分配平衡不能瞬間達到等因素是造成色譜峰擴展、柱效下降的主要原因；通過選擇適當的固定相粒度、載氣種類、液膜厚度及載氣流速可提高柱效；速率理論為色譜分離和操作條件選擇提供了理論指導。闡明了流速和柱溫對柱效及分離的影響；各種因素相互制約，如載氣流速增大，分子擴散項的影響減小，使柱效提高，但同時傳質阻力項的影響增大，又使柱效下降；柱溫升高，有利于傳質，但又加劇了分子擴散的影響。選擇最佳條件，才能使柱效達到最高。

 

色譜定性方法：
023

1 、與標樣對照的方法。利用保留值定性：通過對比試樣中具有與純物質相同保留值的色譜峰，來確定試樣中是否含有該物質及在色譜圖中的位置。不適用于不同儀器上獲得的數據之間的對比。利用加入法定性：將純物質加入到試樣中，觀察各組分色譜峰的相對變化。

2 、利用文獻保留值定性 ：利用相對保留值r21定性。相對保留值r21僅與柱溫和固定相性質有關。在色譜手冊中都列有各種物質在不同固定相上的保留數據，可以用來進行定性鑒定。

 

色譜定量分析：
024

1 、定量校正因子：試樣中各組分質量與其色譜峰面積成正比，即：m i = fi’·Ai絕對校正因子：比例系數f i，單位面積對應的物質量：f i’ =m i/Ai ；相對校正因子f i：即組分的絕對校正因子與標準物質的絕對校正因子之比。

 

2 、常用的幾種定量方法：

（1）歸一化法：特點及要求：歸一化法簡便、準確；進樣量的準確性和操作條件的變動對測定結果影響不大；僅適用于試樣中所有組分全出峰的情況。

（2）外標法——標準曲線法：特點及要求：外標法不使用校正因子，準確性較高，操作條件變化對結果準確性影響較大。對進樣量的準確性控制要求較高，適用于大批量試樣的快速分析。

（3）內標法：內標物要滿足以下要求：(a)試樣中不含有該物質；(b)與被測組分性質比較接近；(c)不與試樣發(fā)生化學反應；(d)出峰位置應位于被測組分附近，且能分離開；(e)加入量適中并與待測組分接近。內標法特點 ：內標法的準確性較高，操作條件和進樣量的稍許變動對定量結果的影響不大；每個試樣的分析，都要進行兩次稱量，不適合大批量試樣的快速分析；若將內標法中的試樣取樣量和內標物加入量固定，則：wi=Ai/As *常數。

氣相色譜法

 

01氣相色譜法(GC )

是以氣體為流動相的色譜分析法。

 

02氣相色譜要求樣品

氣化 ，不適用于大部分沸點高和熱不穩(wěn)定的化合物，對于腐蝕性能和反應性能較強的物質更難于分析。

大約有15%-20%的有機物能用氣相色譜法進行分析。

 

03氣相色譜儀的組成

氣路系統(tǒng)、進樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)、溫控系統(tǒng)、記錄系統(tǒng)。

 

04氣路系統(tǒng)

包括氣源、凈化器和載氣流速控制；常用的載氣有：氫氣、氮氣、氦氣。

 

05進樣系統(tǒng)

包括進樣裝置和氣化室。氣體進樣器(六通閥)：試樣首先充滿定量管，切入后，載氣攜帶定量管中的試樣氣體進入分離柱；液體進樣器：不同規(guī)格的微量注射器，填充柱色譜常用10μL；毛細管色譜常用1μL；新型儀器帶有全自動液體進樣器，清洗、潤沖、取樣、進樣、換樣等過程自動完成，一次可放置數十個試樣。

 

06進樣方式

分流進樣：樣品在汽化室內氣化，蒸氣大部分經分流管道放空，只有極小一部分被載氣導入色譜柱；不分流進樣：樣品直接注入色譜的汽化室，經過揮發(fā)后全部引入色譜柱。

 

07分離系統(tǒng)

色譜柱：填充柱(2-6 mm直徑，1-5 m長)，毛細管柱(0.1-0.5 mm直徑, 幾十米長)。

 

08溫控系統(tǒng)的作用

溫度是色譜分離條件的重要選擇參數：氣化室、色譜柱恒溫箱、檢測器三部分在色譜儀操作時均需控制溫度；氣化室：保證液體試樣瞬間氣化；

檢測器：保證被分離后的組分通過時不在此冷凝；色譜柱恒溫箱：準確控制分離需要的溫度。

 

09檢測系統(tǒng)

作用：將色譜分離后的各組分的量轉變成可測量的電信號；指標：靈敏度、線性范圍、響應速度、結構、通用性。

通用型——對所有物質均有響應；

專屬型——對特定物質有高靈敏響應。檢測器類型：濃度型檢測器：熱導檢測器、電子捕獲檢測器；質量型檢測器：氫火焰離子化檢測器、火焰光度檢測器。

 

10熱導檢測器的主要特點

結構簡單，穩(wěn)定性好；對無機物和有機物都有響應，不破壞樣品；靈敏度不高。

 

11氫火焰離子化檢測器的特點

優(yōu)點：(1)典型的質量型檢測器；(2)通用型檢測器(測含C有機物)；(3)氫焰檢測器具有結構簡單、穩(wěn)定性好、靈敏度高、響應迅速、死體積小、線性范圍寬等特點；(4)比熱導檢測器的靈敏度高出近3個數量級，檢測下限可達10-12g·g-1。

缺點：(1)對載氣要求高(2)檢測時要破壞樣品，無法回收樣品(3)不能檢測永久性氣體、水及四氯化碳等。

 

12電子捕獲檢測器的特點

對鹵素、硫、磷、氮、氧有很強的響應；靈敏度高，可用于痕量農藥殘留物的分析；線性范圍較窄。

 

13火焰光度檢測器(FPD)

是一種對含硫、磷化合物具有高選擇性的檢測器。含硫、磷化合物在富氫火焰中燃燒被打成有機碎片，發(fā)出不同波長的特征光譜。

 

14固定相

固體固定相：固體吸附劑；液體固定相：由載體和固定液組成；聚合物固定相。

 

15固體固定相

一般為固體吸附劑，常用的有活性炭，硅膠，氧化鋁和分子篩。優(yōu)點：吸附容量大、熱穩(wěn)定性好、價格便宜；缺點：柱效低、吸附活性中心易中毒，使用前要進行活化。應用：主要用于惰性氣體、H2、O2、N2、CO、CO2和CH4等一般氣體和低沸點物質。

 

16作為載體使用的物質應滿足的條件

表面有微孔結構，孔徑均勻，比表面積大；化學和物理惰性，即與樣品組分不起化學反應，無吸附作用或吸附很弱；熱穩(wěn)定性好；有一定的機械強度和浸潤性，不易破碎；具有一定的粒度和規(guī)則的形狀，最好是球形。

 

17對固定液的要求

在使用溫度下是液體，具有較低的揮發(fā)性；具有良好的熱穩(wěn)定性；對要分離的各組分應具有合適的分配系數；化學穩(wěn)定性好，不與樣品組分、載氣、載體發(fā)生任何化學反應。

 

18固定液的分類

非極性固定液、中等極性固定液、強極性固定液、氫鍵型固定液。

 

19非極性固定液

主要是一些飽和烷烴和甲基硅油，它們與待測物質分子之間的作用力以色散力為主。組分按沸點由低到高順序流出，若樣品中兼有極性和非極性組分，則同沸點的極性組分先出峰。常用的固定液有角鯊烷(異三十烷)、阿皮松等。適用于非極性和弱極性化合物的分析。

 

20中等極性固定液

由較大的烷基和少量的極性基團或可以誘導極化的基團組成，它們與待測物質分子間的作用力以色散力和誘導力為主，組分基本上按沸點順序出峰，同沸點的非極性組分先出峰。常用的固定液有鄰苯二甲酸二壬酯、聚酯等，適用于弱極性和中等極性化合物的分析。

 

21強極性固定液

含有較強的極性基團，它們與待測物質分子間作用力以靜電力和誘導力為主，組分按極性由小到大的順序出峰。常用的固定液有氧二丙腈等，適用于極性化合物的分析。

 

22氫鍵型固定液

是強極性固定液中特殊的一類，與待測物質分子間作用力以氫鍵力為主，組分依形成氫鍵的難易程度出峰，不易形成氫鍵的組分先出峰。常用的固定液有聚乙二醇、三乙醇胺等，適用于分析含F、N、O等的化合物。

 

23固定液的選擇

（1）按極性相似原則選擇：極性相似，溶解度大，分配系數大，保留時間長:

（2）按官能團相似選擇：酯類---酯或聚酯類固定液；醇類---聚乙二醇固定液。

（3）按主要差別選擇：各組分間沸點是主要差別----非極性固定液；極性為主要差別----極性固定液。

（4）選擇混合固定液：對于難分離的復雜樣品，可選用兩種或兩種以上固定液。

 

24聚合物固定相

既可作為固體固定相，也可作為載體，又稱高分子多孔微球。物質在其表面既存在吸附作用，又存在溶解作用。

（1）具有較大的比表面積，表面孔徑均勻

（2）對非極性及極性物質無有害的吸附活性，拖尾現象小，極性組分也能出對稱峰

（3）由于不存在液膜，無流失現象，熱穩(wěn)定性好

（4）械強度和耐腐蝕性較好，系均勻球形，在填充柱色譜中均勻性、重現性好，有助于減少渦流擴散。

 

25載氣種類的選擇

檢測器的適應性；載氣流速的大小。

 

 

26 柱溫的選擇

（1）首先應使柱溫控制在固定液的最高使用溫度(超過該溫度固定液易流失)和最低使用溫度(低于此溫度固定液以固體形式存在)范圍之內。

（2）提高柱溫，可以改善傳質阻力，有利于提高柱效，縮短分析時間，但降低了容量因子和選擇性，不利于分離。一般的原則是：在使最難分離的組分盡可能分離的前提下，盡量采用較低的柱溫，但以保留時間適宜，峰形不拖尾為度。

（3）柱溫一般選擇在接近或略低于組分平均沸點時的溫度。

（4）組分復雜，沸程寬的試樣，采用程序升溫。

 

27 載體和固定液含量的選擇

配比：固定液在載體上的涂漬量，一般指的是固定液與擔體的百分比，填充柱的配比通常在5%～25%之間。配比越低，擔體上形成的液膜越薄，傳質阻力越小，柱效越高，分析速度也越快。配比較低時，固定相的負載量低，允許的進樣量較小。分析工作中通常傾向于使用較低的配比。

 

28進樣條件的選擇

進樣量應控制在柱容量允許范圍及檢測器線性檢測范圍之內。進樣要求動作快、時間短；氣化室一般較柱溫高30~70°C。

 

29提高色譜分離能力的途徑

（1）塔板理論：增加柱長，減小柱徑，即增加柱子塔板

（2）速率理論：減小組分在柱中的渦流擴散和傳質阻力，可降低塔板高度。

 

30毛細管色譜柱的結構特點

（1）不裝填料阻力小，長度可達百米的毛細管柱，管徑0.2mm。

（2）氣流單途徑通過柱子，消除了組分在柱中的渦流擴散。

（3）固定液直接涂在管壁上，總柱內壁面積較大,涂層很薄，則氣相和液相傳質阻力大大降低。

（4）毛細管色譜柱柱效高達每米3000～4000塊理論塔板，一支長度100米的毛細管柱，總的理論塔板數可達104～106。

 

31毛細管色譜具有以下優(yōu)點

（1）分離效率高：比填充柱高10～100倍；

（2）分析速度快：用毛細管色譜分析比用填充柱色譜速度；

（3）色譜峰窄、峰形對稱。較多采用程序升溫方式；

（4）靈敏度高，一般采用氫焰檢測器；

（5）渦流擴散為零。

 

32毛細管色譜柱的類型

（1）涂壁毛細管柱：將固定液直接涂敷在管內壁上。柱制作相對簡單，但柱制備的重現性差、壽命短。

（2）多孔層毛細管柱：在管壁上涂敷一層多孔性吸附劑固體微粒。構成毛細管氣固色譜。

（3）體涂漬毛細管柱：將非常細的擔體微粒粘接在管壁上，再涂固定液。柱效較涂壁毛細管柱高。

（4）化學鍵合或交聯毛細管柱：將固定液通過化學反應鍵合在管壁上或交聯在一起。使柱效和柱壽命進一步提高。

 

高效液相色譜法

 

01與氣相色譜相比液相色譜的優(yōu)點

 

與氣相色譜法相比，液相色譜法不受樣品揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性及相對分子質量的限制，只要求把樣品制成溶液即可，非常適合于分離生物大分子、離子型化合物，不穩(wěn)定的天然產物以及其他各種高分子化合物等。此外，液相色譜的流動相不僅起到使樣品沿色譜柱移動的作用，而且與固定相一樣，與樣品分子發(fā)生選擇性的相互作用，這就為控制和改善分離條件提供了一個額外的可變因素。而氣相色譜法采用的流動相是惰性氣體，對組分沒有親和力，僅起運載作用。

 

02液相色譜特點

高壓、高速、高效、高靈敏度、高沸點、熱不穩(wěn)定有機及生化試樣的高效分離分析方法。

 

03高效液相相色譜儀的組成

高壓輸液系統(tǒng)、進樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)、數據處理系統(tǒng)。

 

04流動相使用前必須脫氣

常用的脫氣方法有 ：低壓脫氣法(電磁攪拌、水泵抽空，可同時加熱或向溶劑吹氮氣)、吹氦氣脫氣法和超聲波脫氣法等。

 

05梯度洗脫

用兩種(或多種)不同極性的溶劑，在分離過程中按一定程序連續(xù)改變流動相中溶劑的配比和極性，通過流動相中極性的變化來改變被分離組分的分離因素，以提高分離效果。

 

06高壓梯度(內梯度)

特點是先加壓后混合。將溶劑用高壓泵增壓以后輸入色譜系統(tǒng)的梯度混合室，加以混合后送入色譜柱。

低壓梯度(外梯度) ：特點是先混合后加壓。在常壓下預先按一定的程序將溶劑混合后再用泵輸入色譜柱。

 

07進樣系統(tǒng)要求

 良好的密封性，最小的死體積，最好的穩(wěn)定性，進樣時對色譜系統(tǒng)壓力、流量影響較小。

 

08分離系統(tǒng)

色譜柱是實現分離的核心部件。由柱管和固定相組成。柱管為直型不銹鋼管。一般色譜柱長5~30 cm，內徑4~5 mm，凝膠色譜柱內徑3~12 mm，而制備色譜柱內徑則可達25 mm。一般淋洗溶劑在進入色譜分離柱之前，先通過前置柱。HPLC柱的填料顆粒粒徑一般約為3~10 mm，填充常采用勻漿法。色譜柱的發(fā)展趨勢是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。

 

09檢測系統(tǒng)

作用——用來連續(xù)監(jiān)測經色譜柱分離后的流出物的組成和含量變化的裝置。紫外-可見吸收檢測器、光電二極管陣列檢測器、示差折光檢測器、熒光檢測器、電化學檢測器。

 

10 高效液相色譜法對流動相的要求

流動相不與色譜柱發(fā)生不可逆化學變化，以保持柱效或柱子的保留性質較長時間不變；對待測樣品有足夠的溶解能力；與所用檢測器相匹配；粘度盡可能小，以獲得較高的柱效；流動相純度要高，價格便宜，毒性小。

 

11高效液相色譜法的固定相的分類

（1）按固定相承受壓力分：剛性固體：以二氧化硅為基質，可承受較高壓力，表面可鍵合各種功能官能團---鍵合固定相，是目前應用最廣泛的固定相。硬膠：主要用于離子交換色譜法和凝膠色譜法中，由聚苯乙烯與二乙烯基苯交聯而成，可承受的壓力較低。

（2）按孔隙深度分：表面多孔型：基體是球形玻璃珠，在玻璃表面涂覆一層多孔活性物質如硅膠、氧化鋁、聚酰胺、離子交換樹脂、分子篩等。優(yōu)點：適用于快速分離、填充均勻緊密、機械強度高、能承受高壓，適于簡單的樣品及常規(guī)分析:缺點：多孔層薄，進樣量受限制。全多孔型：由硅膠顆粒聚集而成，比表面積大，柱容量大，小顆粒全孔型固定相孔洞淺傳質速率快，柱效高，分離效果好，適合于復雜樣品、痕量組分的分離分析，是目前HPLC中應用最廣泛的固定相。

 

12液固吸附色譜法原理

是以固體吸附劑為固定相，吸附劑表面的活性中心具有吸附能力，試樣分子被流動相帶入柱內時，它將與流動相溶劑分子在吸附劑表面發(fā)生競爭吸附。分離過程是一個吸附-解吸的平衡過程。

 

13液固吸附色譜法固定相

 通常是硅膠、氧化鋁、活性炭等固體吸附劑。硅膠最常用。流動相：極性大的試樣需用極性強的洗脫劑，極性弱的試樣宜用極性弱的洗脫劑。應用 ：幾何異構體分離和族分離，如農藥異構體；石油中烷、烯、芳烴的分離。不適于強極性的離子型樣品的分離，不適于分離同系物(因為它對相對分子質量的選擇性較小)。

 

14液液分配色譜法原理

根據物質在兩種互不相溶(或部分互溶)的液體中溶解度的不同實現分離。分配系數較大的組分保留值也較大。

 

15液液分配色譜法流動相

流動相與固定液應盡量不互溶，或者二者的極性相差越大越好。根據流動相與固定相極性的差別程度，可將液液色譜分為正相分配色譜(流動相極性小于固定相極性，極性小的先流出，適于強極性和中等極性組分分離)和反相分配色譜(流動相極性大于固定相極性，極性大的先流出，適于非極性或弱極性組分分離)。固定相 ：由載體和固定液組成。常用的固定液有b，b’-氧二丙腈、聚乙二醇、聚酰胺、正十八烷、角鯊烷等。應用 ：同系物組分的分離。例：分離水解蛋白質所生成的各種氨基酸，分離脂肪酸同系物等。

 

16化學鍵合固定相

化學鍵合固定相是利用化學反應將有機分子鍵合到載體表面上，形成均一、牢固的單分子薄層而構成各種性能的固定相。

 

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化學鍵合固定相的特點

固定相不易流失，柱的穩(wěn)定性和壽命較高；能耐受各種溶劑，可用于梯度洗脫；表面較為均一。沒有液坑，傳質快，柱效高；能鍵合不同基團以改變其選擇性。例如，鍵合氰基、氨基等極性集團用于正相色譜法，鍵合離子交換基團用于離子色譜法，鍵合C2，C4，C6，C8，C18，C16，C18，C22烷基和苯基等非極性基團用于反相色譜法等。因此，它是HPLC較為理想的固定相。

 

18離子交換色譜法原理

離子交換色譜法的固定相是離子交換樹脂，流動相是水溶液，它是利用待測樣品中各組分離子與離子交換樹脂的親和力的不同而進行分離的。

 

19離子交換色譜法流動相

水的緩沖溶液。陰離子離子交換樹脂作固定相，采用酸性水溶液；陽離子離子交換樹脂作固定相，采用堿性水溶液；應用：離子及可離解的化合物，氨基酸、核酸等。

 

20凝膠色譜法原理

凝膠色譜法的固定相為多孔性凝膠類物質，流動相為水溶液或有機溶劑，它是根據不同組分分子體積的大小進行分離的。小分子可以擴散到凝膠空隙，由其中通過，出峰最慢；中等分子只能通過部分凝膠空隙，中速通過；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶劑分子小，故在最后出峰。全部在死體積前出峰；可對相對分子質量在100-105范圍內的化合物按質量分離。

 

21凝膠色譜法流動相

能溶解樣品且與凝膠相似(潤濕凝膠并防止吸附作用)、粘度小(增加擴散速度)。常用四氫呋喃、苯、氯仿、水等。

 

22影響分離的因素與提高柱效的途徑

（1）液體的黏度比氣體大一百倍，密度為氣體的一千倍左右，故降低傳質阻力是提高柱效主要途徑。

（2）由速率方程，降低固定相粒度可提高柱效。

（3）液相色譜中，不可能通過增加柱溫來改善傳質。

（4）恒溫改變淋洗液組成、極性是改善分離的最直接的因素。

（5）流速大于0.5 cm/s時, H～u曲線是一段斜率不大的直線。降低流速，柱效提高不是很大。但在實際操作中，流量仍是一個調整分離度和出峰時間的重要可選擇參數。

（6）氣相色譜中的固定液原則上都可以用于液相色譜，其選用原則與氣相色譜一樣。但在高效液相色譜中，分離柱的制備是一項技術要求非常高的工作，一般很少自行制備。

 

質譜分析法

 

01質譜法定義

將待測物質置于離子源中電離形成帶電離子，讓離子加速并通過磁場或電場后，離子將按質荷比(m/z)大小分離，形成質譜圖。依據質譜線的位置和質譜線的相對強度建立的分析方法稱為質譜法。

 

02質譜的作用

準確測定物質的分子量；質譜法是唯一可以確定分子式的方法；根據碎片特征進行化合物的結構分析。

 

03質譜分析的基本原理

質譜法是利用電磁學原理，將待測樣品分子解離成具有不同質量的離子，然后按其質荷比(m/z)的大小依次排列收集成質譜。根據質譜中的分子離子峰(M·+)可以獲得樣品分子的相對分子質量信息；根據各離子峰(分子離子峰、同位素離子峰、碎片離子峰、亞穩(wěn)離子峰、重排離子峰等)及其相對強度和氮數規(guī)則，可以確定化合物的分子式；根據各離子峰及物質化學鍵的斷裂規(guī)律可以進行定性分析和結構分析；根據組分質譜峰的峰高與濃度間的線性關系可以進行定量分析。

 

04質譜分析的過程

（1）進樣，化合物通過汽化引入電離室；

（2）離子化，在電離室，組分分子被一束加速電子碰撞，撞擊使分子電離形成正離子；

（3）離子也可因撞擊強烈而形成碎片離子；

（4）荷正電離子被加速電壓V加速，產生一定的速度v，與質量、電荷及加速電壓有關；

（5）加速正離子進入一個強度為B的磁場(質量分析器)，發(fā)生偏轉。

 

05質譜儀的組成

真空系統(tǒng)、進樣系統(tǒng)、離子源或電離室、質量分析器、離子檢測器。

 

06真空系統(tǒng)作用

減少離子碰撞損失。若真空度低：大量氧會燒壞離子源的燈絲；會使本底增高，干擾質譜圖；引起額外的離子-分子反應，改變裂解模型，使質譜解釋復雜化；干擾離子源中電子束的正常調節(jié)；用作加速離子的幾千伏高壓會引起放電等。

 

07進樣系統(tǒng)目的

高效重復地將樣品引入到離子源中并且不能造成真空度的降低。間歇式進樣系統(tǒng)——氣體及低沸點、易揮發(fā)的液體；直接探針進樣——高沸點的液體、固體；色譜進樣系統(tǒng)——有機化合物。

 

08離子源或電離室

作用是使試樣中的原子、分子電離成離子，其性能影響質譜儀的靈敏度和分辨率本領。8電子電離源的特點：電離電壓：70eV;；加一小磁場增加電離幾率；EI源電離效率高,碎片離子多，結構信息豐富，有標準化合物質譜庫；結構簡單，操作方便；樣品在氣態(tài)下電離，不能汽化的樣品不能分析，主要用于氣-質聯用儀；有些樣品得不到分子離子。

 

09化學電離源特點

電離能小，質譜峰數少，譜圖簡單；最強峰為(M+1)+準分子離子峰；不適用難揮發(fā)試樣。

 

10原子轟擊源

高能量的Xe原子轟擊涂在靶上的樣品，濺射出離子流。本法適合于高極性、大分子量、低蒸汽壓、熱穩(wěn)定性差的樣品。FAB一般用作磁式質譜的離子源。

 

11電噴霧源結構

噴嘴(金屬毛細管)，霧化氣，干燥氣。原理：噴霧蒸發(fā)電壓。特點：ESI是最軟的一種電離方式，只產生分子離子，不產生碎片離子；適用于強極性，大分子量的樣品分析，如肽，蛋白質，糖等；產生的離子帶有多電荷，尤其是生物大分子；主要用于液相色譜-質譜聯用儀，既用作液相色譜和質譜儀之間的接口裝置，同時又是電離裝置。

 

12 場致電離源(FI) 和場解吸電離源(FD)

 分子離子峰強，碎片離子峰少，不適合化合物結構鑒定。

 

13基質輔助激光解吸電離特點

準分子離子峰很強，且碎片離子少。通常用于飛行時間質譜，特別適合測定多肽、蛋白質、DNA片段、多糖等的相對分子質量。

 

14質量分析器作用

將離子源產生的離子按質荷比m/z的大小分開。

 

15單聚焦分析器

離子的m/z與R,B, V有關。通過改變磁場可以把不同離子分開。-在一定磁感應強度B下，改變加速電壓V可以使不同離子先后通過檢測器，實現質量掃描，得到質譜。特點：結構簡單，操作方便；只有方向聚焦，無能量聚焦，分辨率低。

 

16雙聚焦分析器

實現方向聚焦和能量(速度)聚焦；對于動能不同的離子，通過調節(jié)電場能，達到聚焦的目的。特點：分辨率高。

 

17四級桿質量分析器

特點：結構簡單，體積小、重量輕，掃描速率快，適合與色譜聯機。

 

18飛行時間質量分析器

特點：質量范圍寬，掃描速率快，既不需磁場也不需電場，只需要直線漂移空間。

 

19離子阱質量分析器

特定m/z離子在阱內一定軌道上穩(wěn)定旋轉，改變端電極電壓，不同m/z離子飛出阱到達檢測器。特點：結構簡單、易于操作、靈敏度高。

 

20質譜的表示方法

質譜一般可用線譜或表譜兩種方法表示。常用線譜；線譜上的各條直線表示一個離子峰，橫坐標為質荷比m/z，縱坐標為離子的相對強度(相對豐度)，一般將原始質譜圖上最強的離子峰定為基峰并定為相對強度100%，其他離子峰以對基峰的相對百分值表示。能夠很直觀地觀察到整個分子的質譜全貌；質譜表是用表格形式表示的質譜數據，質譜表中有兩項即質荷比及相對強度。對定量計算較直觀。

分辨率(R)指質譜儀能區(qū)別鄰近兩個質譜峰的能力。對兩個相等強度的相鄰峰，當兩峰間的峰谷不大于其峰高10%時，則認為兩峰已經分開。

 

22質譜圖中主要離子峰的類型

分子離子峰、同位素離子峰、碎片離子峰、亞穩(wěn)離子峰、重排離子峰。

 

23相對分子質量的測定

分子離子峰的m/z相當于該化合物的相對分子質量。一般除同位素離子峰外，分子離子峰是質譜圖中最大質荷比的峰，位于質譜圖的最右端。

 

24確認分子離子峰的方法

(1)分子離子峰必須符合氮數規(guī)則。有機化合物含有偶數個氮原子或不含氮原子，分子離子峰的m/z一定是偶數；含奇數個氮原子，分子離子峰的m/z一定是奇數。

(2)分子離子峰與相鄰離子峰的質量差應合理，如不可能出現比分子離子峰質量小4～13個質量單位的峰。

(3)當化合物中含S,Br, Cl時，可利用M+·, (M+2) +·等同位素離子峰的比例來確認分子離子峰。

(4)改變質譜儀的操作條件，提高分子離子峰的相對強度。采用化學電離源或降低電子轟擊源電壓可獲得較強的M+峰。

 

25氣相色譜-質譜聯用儀

質譜：純物質結構分析。色譜：化合物分離，定性能力差。色譜-質譜聯用：共同優(yōu)點。GC-MS;LC-MS;CE-MS，色譜是質譜的進樣及分離系統(tǒng)；質譜是色譜的檢測器。主要問題：接口技術；除去色譜中大量的流動相分子。適用范圍：適用于揮發(fā)度低、難氣化、極性強、相對分子質量大及熱穩(wěn)定性差的樣品。

 

26無損檢測定義

 無損檢測技術即非破壞性檢測，就是在不破壞待測物質原來的狀態(tài)、化學性質等前提下，為獲取與待測物的品質有關的內容、性質或成分等物理、化學情報所采用的檢查方法。