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蛋白質(zhì)是構(gòu)成生物體細胞組織的重要成分。食物中的蛋白質(zhì)是人體中氮的唯一來源，具有不可替代的作用。含氮是蛋白質(zhì)區(qū)別于其他有機化合物的重要標志。在檢驗食品中蛋白質(zhì)時，通常是先檢定出食品中的總氮量，然后乘以蛋白質(zhì)換算系數(shù)，以此得到蛋白質(zhì)含量。凱氏定氮法由Kieldahl于1883年首先提出，至今仍被作為標準檢驗方法。凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)分為樣品消化、蒸餾、吸收和滴定過程。
原理
樣品消化
蒸餾
吸收
滴定
注意事項
常見問題解答
向樣品中加入濃硫酸和催化劑，充分混勻，然后加熱消化分解，樣中碳和氫被氧化成二氧化碳和水，其中的有機氮轉(zhuǎn)化為硫酸銨。堿化蒸餾使氨游離，用硼酸吸收后以硫酸或鹽酸標準滴定溶液滴定，根據(jù)酸的消耗量乘以換算系數(shù)，即為蛋白質(zhì)的含量。
濃硫酸具有脫水性和氧化性，可使有機物中的碳、氫被氧化為二氧化碳和水，蛋白質(zhì)會分解為氨，然后氨與硫酸結(jié)合生成硫酸銨。通常加入硫酸鉀和硫酸銅作為催化劑來加快蛋白質(zhì)分解。硫酸鉀可以提高溶液的沸點，一般情況下，純硫酸的沸點在340℃左右，但是在添加硫酸鉀后，可提高至400℃以上。提高溫度使有機物加快分解。但是不能加入過多的硫酸鉀，否則會因為溫度過高，使生成的硫酸銨發(fā)生熱分解成氨而造成損失。硫酸銅除作為催化劑外，還可以指示消化終點的到達，有機物全部消化完全后，溶液呈現(xiàn)清澈的藍綠色，硫酸銅還可以做蒸餾時堿性反應的指示劑。
消化液中的硫酸銨在堿性環(huán)境下會轉(zhuǎn)化成氨。為防止水中微量的氨氣受熱逸出，影響測定結(jié)果，所以水蒸氣發(fā)生器中的水要保持酸性。硫酸銨是一種強酸弱堿鹽，需要足夠的堿液使結(jié)合態(tài)的氨完全反應并釋放出來，這個過程中的氫氧化鈉一定要過量，過量的氫氧化鈉會與硫酸銅生成藍色的氫氧化銅沉淀，氫氧化銅受熱分解成黑色的氧化銅沉淀。檢驗蒸餾是否完成，可用奈氏試紙法，NH4+或NH3遇奈氏試劑會反應生成棕紅色的碘化汞銨化合物。
加熱蒸餾放出的氨可用硼酸溶液吸收，硼酸有吸收氨的作用，又因其呈微弱酸性，不影響下一步滴定時指示劑的變色反應。溫度過高會使硼酸吸收液對氨的吸收作用減弱，從而造成損失，故一般不超過40 ℃。
待吸收完全后，用硫酸或者鹽酸標準溶液進行酸堿滴定，滴定液的濃度直接影響結(jié)果的準確性，必須按照要求進行配制和標定。混合指示劑在中性溶液中呈灰色，滴定終點時液體呈灰色。
一、消化過程中容易沾壁怎么辦？消化后定氮瓶內(nèi)有黑色殘留物怎么辦？
解答：稱樣時需要注意切勿使樣品粘附在定氮瓶頸部，避免因樣品未消化完全而造成結(jié)果偏低。消化過程中如果發(fā)生沾壁在定氮瓶肚上或者定氮瓶肚上有黑色殘留物，可以在消化較完全時搖動定氮瓶，把定氮瓶肚上的黑色物質(zhì)搖洗下來。搖動的方法是取下小漏斗，戴上防燙手套，手掌緊握瓶頸，向前后側(cè)甩，使瓶內(nèi)液體呈半旋轉(zhuǎn)半振蕩狀態(tài)，注意控制力度不要讓液體濺離瓶口。
二、硫酸鉀的作用是催化劑嗎？
解答：硫酸鉀的作用是提高溶液沸點，從而加快有機物分解。
三、硫酸銅是否是消化終點以及加堿蒸餾時的指示劑？
解答：硫酸銅的作用有三個，分別為：
①催化作用：加速有機物的氧化分解。
②消化完全的指示劑：使液體呈現(xiàn)藍綠色澄清透明狀態(tài)。
③蒸餾時堿性反應的指示劑：產(chǎn)生褐色沉淀。
四、混合指示劑必須臨用時混合嗎？
解答：混合指示劑必須臨用時混合。
五、請問蒸餾的時取下錐形瓶，需要用洗瓶沖洗嗎？不沖洗會有誤差嗎？
解答：需要沖洗冷凝管下端以防止產(chǎn)生結(jié)果誤差。蒸餾后移動蒸餾液接收瓶,液面離開冷凝管下端,再蒸餾1min。然后用少量水沖洗冷凝管下端外部,然后取下蒸餾液接收瓶。
六、蒸餾儀器的檢漏如何操作？
解答：可以將蒸餾裝置連接好后，在接口以及瓶塞等可能漏氣的地方滴加少量水，打開電爐加熱，觀察有無氣泡產(chǎn)生。
七、硼酸可以多加嗎？
解答：不可以。按國標的要求正確操作，10mL硼酸足夠。
八、滴定時消耗了很多鹽酸溶液，能否換濃度高的鹽酸溶液滴定？
解答：不能更改國標給出的滴定液濃度。蛋白質(zhì)含量較高的樣品可以適當減少稱樣量，或合理范圍內(nèi)減少吸取消化液的體積V3。
九、空白消耗標準滴定液的體積指的是什么？
解答：試劑空白實驗消耗的標準滴定溶液的體積就是空白體積。
十、同時有兩種蛋白怎么換算？
解答：同時含有多種蛋白質(zhì)，且折算系數(shù)不相同時可以按復合配方食品換算蛋白質(zhì)系數(shù)。
結(jié)語：凱氏定氮法經(jīng)典、準確，適用于食品中蛋白質(zhì)的測定。但是因樣品中一般會含有一些非蛋白質(zhì)的含氮化合物，所以凱氏定氮法測定結(jié)果為樣品中粗蛋白質(zhì)含量。然而，此法實際上測的不是蛋白質(zhì)含量，而是通過測氮含量來推算出樣品中蛋白質(zhì)的含量。在凱氏定氮法中消化操作的條件是產(chǎn)生誤差的主要原因，因此要格外注意。在實際的生產(chǎn)實驗中，每一步應該嚴格按照標準的規(guī)定來進行操作。本文為筆者日常工作實驗總結(jié)所得，望對實驗者有些許幫助。
